TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Резюме

Мы опишем пошаговое протокол для тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), который позволяет проводить анализ изменения определенного типа клеток геном wide гистонов.

Аннотация

Эпигеномные регулирование играет центральную роль в экспрессии генов. Поскольку изменения гистона был обнаружен в 1960-х, его физиологических и патологических функции были широко изучены. Действительно появление глубоких секвенирование нового поколения и иммунопреципитации chromatin (чип) через конкретные гистона модификации антитела изменил наш взгляд эпигеномные регулирования через генома. И наоборот тканей, как правило, состоят из типов различных клеток, и их сложные смеси создает аналитические проблемы для расследования epigenome в конкретной ячейке тип. Для решения состояния конкретного типа хроматин клеток в геном всей манере, мы недавно разработали тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), которая основана на выборочной очистки хроматина тегами ядро гистоны из ячейки виды интересов, следуют чип-Seq. Целью настоящего Протокола является внедрение наилучшей практики tChIP-след Эта технология предоставляет универсальный инструмент для epigenome ткани конкретного расследования гистона различных модификаций и модельные организмы.

Введение

Ткани животных состоят из клеток различных типов. Ген регулирование в каждой ячейке определяет тип ячейки. Chromatin изменения - ДНК метилирования и гистонов модификации - лежат в основе тип ячейки специфика экспрессии генов. Таким образом необходимости измерения эпигеномные регулирования в каждой ячейке тип, но это был технический вызов.

Расследовать эпигенетики в конкретной ячейке тип, секвенирование иммунопреципитации chromatin тандем (tChIP-Seq) был недавно разработанных ()Рисунок 1)¹. В tChIP белка гистонов epitope тегами ядро H2B выражается от промоутера определенного типа клеток. Эта функция позволяет изоляции chromatins из клеток интерес, хотя материал начинается из смеси различных типов клеток. Следующие чип-Seq — хроматина очищение через изменение гистона Марк и глубокие секвенирование нового поколения изолированной ДНК — мы можем контролировать эпигеномные статус тип целевой ячейки в геном всей манере.

Используя эту технику, мы недавно исследовали нейрон конкретных trimethylation гистонов H3 белка на лизина 4 (H3K4me3) знаки. В этом исследовании мы разработали стук в мышь, в котором C-неизлечимо флаг тегами H2B белка была выражена при рекомбинации Cre опосредованной (Rosa26^{ЦАГ floxed ПА H2B-флаг}). Путем скрещивания с помощью мыши, имеющих КРР эндоплазматического ретикулума (ER) гена под контролем промотора CamK2a, полученные мыши линии индуцированной H2B-флаг в активных нейронов на тамоксифен инъекций (Camk2a^H2B-флаг)¹. Начиная от мозга установленной мыши линии, мы провели tChIP-Seq с анти H3K4me3 антител. Так как H3K4me3 знаки часто соответствуют промоутер регионов, мы могли бы обнаружить сотни мРНК, конкретно выражена в нейроны¹.

Здесь мы описываем метод типичный tChIP-Seq, который охватывает шаги от рассечение тканей для библиотеки строительных ()Рисунок 1). Конечная цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы поделиться своим передовым опытом для выполнения tChIP-Seq и будущее применение этого метода в другие типы клеток и изменения гистона.

протокол

Все методы, описанные здесь были утверждены отделом безопасности RIKEN (H27-EP071) и проведены с соответствующими руководящими принципами и правилами.

1. рассечение тканей

1. Вскрыть тканях интерес на мелкие кусочки (примерно < 3 мм²) с помощью тонкой весной ножницы.
   Примечание: Большие фрагменты тканей занять больше времени, чтобы заморозить, и более мелкие куски будут перенесены больший объем буфера, оба из которых могут повлиять на результаты.
2. Добавить фрагменты Иссеченную ткань в чистый контейнер с жидким азотом и собирать их в 2 мл пробирки (1 штука в трубку) заполнены с жидким азотом.
   Примечание: Трубы с гидрофильной поверхностью рекомендуются для этого шага.
3. Место труб при температуре-80 ° C > 5 мин с крышкой, открытым для испарения оставшиеся жидкого азота.
   Примечание: После закрытия крышки, фрагменты тканей может храниться при температуре-80 ° C на один месяц перед использованием.

2. ячейки фиксации

Примечание: Мы использовали удобный криогенных дробилка для этого шага. Альтернативные аппарат может быть использован.

1. Место 2 мл белок низкой привязки пробирки, содержащие образцы тканей на шкаф металлический льда охлажденной в жидком азоте.
2. Место металлическая пуля в 1,5 мл трубки и холод с жидким азотом. Поместите его на решетку металла льда.
3. Откройте 2 мл и место prechilled металлическая пуля в трубу. Закройте крышку, установите 2 мл трубы в Трубодержатель удобный криогенных точильщика и сразу окунуть собрал Трубодержатель в жидком азоте за 1 мин.
4. Вставьте держатель замороженные трубы в наружной кассеты удобный криогенных точильщика и встряхнуть 60 раз за 30 s.
5. Разбирать держателя трубки, удалите металлические пули и место 2 мл на образец охладителя prechilled при-20 ° C.
6. Поместите образец охладителя при-20 ° C на 15 минут предотвратить замораживание фиксатором на следующем шаге.
7. Привести пример кулер на скамейке, откройте крышку трубки и сразу же капать 900 мкл 1% формальдегида в него. После закупорить несколько раз, перевести подвеска на новый 2 мл трубка, содержащая 900 мкл 1% формальдегида и исправления для 10 мин с нежным вращение в инкубаторе в 23 ° C.
   Предупреждение: Формальдегид токсичных и вредных.
8. Чтобы остановить реакции фиксации, добавьте 100 мкл 2,5 метров глицина каждой трубки и центрифуги для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C. Выбросите супернатант.
9. Добавьте 1 mL ледяной фосфат амортизированное saline (PBS), центрифуги для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и отбросить супернатант. Повторите этот шаг два раза (3 стирок в общей сложности).
   Примечание: Фиксированная образцов может быть флэш заморожены жидким азотом и хранятся при температуре-80 ° C.
10. Добавьте 500 мкл буфера Lysis 1 (50 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES)-Кох (рН 7,5), 140 мм NaCl, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (рН 8,0), 10% w/v глицерина, 0,5% w/v NP-40, ингибитор протеазы X-100 и 0,1 x 0,25% w/v Тритон коктейль) Пелле, накапайте несколько раз и поворот на 10 мин при 4 ° C.
    Примечание: Буфера Lysis 1 следует фильтровать и хранить при 4 ° C перед использованием.
11. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
12. Добавьте 1 mL 2 буфера Lysis (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 200 мм NaCl, 1 мм ЭДТА (рН 8,0), 0,5 мм EGTA и 0.1 x коктейль ингибитор протеазы) Пелле, вихрь и поворот на 10 мин при 4 ° C.
    Примечание: Буфера Lysis 2 следует фильтровать и хранить при 4 ° C перед использованием.
13. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
14. Добавить 800 мкл аналитического (RIPA) буфера radioimmunoprecipitation с ингибитором протеазы 1 x коктейль гранулы и Ресуспензируйте гранулы, закупорить.
15. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
16. 500 мкл буфера РИПА с 1 x ингибитор протеазы коктейль.
17. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
18. Добавьте 1 mL Буфер RIPA с 1 x ингибитор протеазы коктейль. Сразу же переходите к следующему шагу.

3. chromatin стрижка

1. Lysate передать трубку sonicator и затем поместите трубку на ultrasonicator.
2. Наклонить хроматина со следующими параметрами: температура: 4 ° C; инцидент Пиковая мощность: 175 Вт; коэффициент: 10%; циклы/серия: 200; и время: 2400 s.
3. Передать образец 1,5 мл белок низкой привязка трубки и центрифуги для 5 минут на 20 000 x g при 4 ° C.
4. Соберите супернатант в новой трубки низкого привязки белка.
   Примечание: Образец может быть флэш замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C.

4. качество проверки ДНК (обратный сшивки)

1. Микс 20 мкл lysate и 180 мкл буфера чип (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 300 мм NaCl, 5 мм ЭДТА (рН 8.0) и лаурилсульфат натрия 1% w/v (SDS)) в трубе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Инкубируйте образца при 65 ° C в тепловой cycler для 6 h с открытой крышкой тепловая велосипедист. Держите крышку открыть тепловая велосипедист, чтобы избежать чрезмерной денатурации.
   Примечание: Чип Элюирующий буфер должен фильтруется и хранятся при комнатной температуре перед использованием. Этот инкубации может быть продлен на ночь.
2. 1 мкл 10 мг/мл РНКазы, вихрь и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
3. 6,5 мкл 15 mg/ml протеиназы K, вихрь и Инкубируйте на 55 ° C для 60 мин.
4. Перенесите реакция на трубу ДНК низкой привязки, 4 мкл гликогена 5 мг/мл и вихрь. Затем добавьте 200 мкл фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и центрифуги для 5 мин на 18,000 x g при комнатной температуре.
5. Супернатант передать новой трубки низкого привязки ДНК. Добавить 200 мкл буфера Tris-ЭДТА-NaCl (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 1 мм ЭДТА (рН 8.0) и 200 мм NaCl) оставшийся раствор фенола/хлороформ/изоамилового спирта и центрифуги для 5 мин на 18,000 x g при комнатной температуре. Собирать супернатант и смешать с первого супернатант.
6. 900 мкл ледяной этанола и инкубировать 1 час при температуре-20 ° C.
   Примечание: Этот инкубации может продлеваться до 4 - 6 ч.
7. Центрифуги для 30 мин на 18,000 x g при 4 ° C.
8. Выбросите супернатант. Добавьте 1 mL ледяной 75% этанола в гранулах и центрифуги для 30 мин на 18,000 x g при 4 ° C. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
9. Тщательно удалить супернатант и просушите при комнатной температуре 1 мин.
10. Добавьте 50 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE) и растворить ДНК путем инкубации его при комнатной температуре в течение 30 минут или при температуре 4 ° C на ночь. Избегайте vortexing или закупорить. Держите этот ДНК как «входной» и использовать его для приготовления библиотеки при необходимости.
11. Измерить концентрации ДНК с флуориметр согласно инструкции производителя (см. таблицу материалы) и проверить распределение размеров с машиной microfluidic электрофореза (см. репрезентативных данных, показано в Рисунок 2a). Использование 10 нг или меньше ДНК для этот assay.
    Примечание: Фрагменты 100 – 500 пар оснований (ВР) должен составлять 50% или больше из ДНК.

5. сродства очищения, антитела анти флаг

Примечание: Для tChIP нейрон-Seq, тканях мозга от 8 мышей обычно используются для один образец tChIP-Seq для подготовки 2 нг очищенная ДНК иммунной тандем-очищение (см. шаг 7.1). В наших руках 0.1 нг ДНК, по-прежнему предоставляет высококачественные ДНК библиотеки для чип-Seq (Kadota, неопубликованные). Таким образом в теории, одной мыши может быть достаточно для выполнения нейрон tChIP-Seq. Требуемая сумма должна быть оптимизирована для тканей и клеток типа интереса. Для отрицательного контроля imumuno очистка эксперимента мозговой ткани lysate от мышей без каких-либо H2B-флаг выражение следует подготовить и используется.

1. Пипетка 200 мкл магнитные бусы, конъюгированных овец анти мыши иммуноглобулина G (IgG) в трубку низкой связывания белков.
2. Установите трубу на магнитного стенд и подождите 1 мин для супернатант станет ясно. Отбросить супернатанта, добавьте 1 mL ледяной PBS, и вихрь. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
3. 20 мкл антител анти флаг 1 мг/мл и вращаться в течение 5 ч при 4 ° C.
   Примечание: Этот инкубации может быть продлен на ночь.
4. Мыть после шаг 5.2 бусины. Место шарики в 15 мл.
5. Ресуспензируйте бисер в 1110 мкл Буфер RIPA и затем 900 мкл 10 x блокирование реагента, 180 мкл 50 x Денхардта в раствор, 10 µL 100 x ингибитор протеазы коктейль и 6,8 мл lysate подготовлен на шаге 3. Разделить смесь на 5 белок низкой привязки труб. Вращаться в течение 6 ч при 4 ° C.
   Примечание: Этот инкубации может быть продлен на ночь.
6. Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отменить супернатанта, добавляют 1 мл Буфер RIPA и аккуратно перемешать. Повторите этот шаг 5 раз (6 моет в общей сложности). Объединить все бусины в один белок низкой привязки трубку.
7. Добавить 200 мкл рабочего раствора микросхемы Элюирующий буфер и вращаться в течение 15 минут при комнатной температуре. Проверьте качество ДНК, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2B и C). Сразу же переходите к следующему шагу.

6. сродства очищения антитела анти H3K4me3 и обратного сшивания

Примечание: Следующие шарик подготовка выполненных шагов (6.1-6.4) до 5,7 шаг.

1. Пипетка 40 мкл магнитной бусины, конъюгированных овец анти мыши IgG в трубку 2 мл белок низкой привязки.
2. Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отбросить супернатанта, добавляют 1 мл ледяной PBS и осторожно перемешать. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
3. 4 мкл антител анти H3K4me3 1 мг/мл и вращаться в течение 6 ч при 4 ° C.
4. Мыть после шаг 6.2 бусины. Место шарики в трубку 2 мл белок низкой привязки.
5. Ресуспензируйте бисер в 1558 мкл RIPA буфера, а затем добавить 200 мкл 10 x блокирование реагента, 40 мкл 50 x Денхардта в раствор, 2 мкл, 100 x ингибитор протеазы коктейль и 200 мкл элюата, подготовлено в 5.7 шаг. Поворот на ночь при 4 ° C.
   Примечание: SDS в чип Элюирующий буфер был разбавлен более чем 10 раз в этом инкубации.
6. Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отменить супернатанта, добавляют 1 мл Буфер RIPA и аккуратно перемешать. Повторите этот шаг 4 раза (5 стирок в общей сложности). После последнего мыть передача бисер в ДНК низкой привязки трубку и удалить супернатант.
7. Добавить 200 мкл рабочего раствора микросхемы Элюирующий буфер и вращаться в течение 15 минут при комнатной температуре. Передача элюата в новой низким bindingTube ДНК.
   Примечание: Элюата может храниться при температуре-80 ° C.
8. Выполните шаг 4 для decrosslinking ДНК. Ресуспензируйте очищенная ДНК в 20 мкл буфера TE.
9. Проверьте качество ДНК, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2D). (необязательно) Выполнить анализ обогащения путем количественного PCR как описано выше². Десятикратное или большего обогащения должны соблюдаться.

7. Библиотека строительство

1. Для каждого входа и образец ДНК чип рассчитайте долю ДНК в регионе 100 – 500-bp, используя функцию анализа мазка программного обеспечения для машины microfluidic электрофореза. Оценить объем пробы, необходимые для получения 2 нг 100 – 500 bp ДНК. Используйте 20 нг ДНК в диапазоне 100 – 500-bp образцом «вход».
2. Пипетка образцы ДНК в пробирки 8-газа ПЦР и добавьте H₂O довести объем до 10 мкл. (необязательно) Если объем ДНК превышает 10 мкл, пропорционально шкале вверх следующие реакции конец ремонт и выбор размера.
3. Подготовьте конец ремонт Мастер микс (см. Таблицу материалы). 4 мкл конец ремонт мастер смеси ДНК и Инкубируйте 30 мин при 20 ° C.
4. 36 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 и объем 0,6 x (30 мкл) твердых этапа реверсивные иммобилизации (ОСПР) магнитные бусы и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
6. Супернатант передать новой трубки, добавьте 1.2 x тома (60 мкл) Спри магнитные бусы и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
7. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
8. Вымойте бусины дважды с 200 мкл 80% EtOH, держа трубку до сих пор на магните.
9. Кратко центрифуга трубка для сбора остаточной EtOH внизу и поместить его обратно на магните. Тщательно удалите остаточную EtOH.
10. Не закрывайте крышку трубки, для 1-2 мин позволить EtOH испаряться.
11. Закройте крышкой и держать трубку на льду.
    Примечание: Теперь вы получили выбран размер ДНК 100 – 500 bp на бисер. Более подробная информация о двойной размер выделения можно найти на сайте производителя (www.beckman.com).
12. Подготовка мастер A-хвостохранилища смесь (см. Таблицу материалы).
13. Ресуспензируйте бусины (от шаг 7.10) с 10 мкл мастер смесь A-хвостохранилища и Инкубируйте 30 мин при температуре 30 ° C.
14. Добавить объем 1.8 x (18 мкл) от полиэтиленгликоля (PEG) / раствор NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
15. Выполните шаги 7,7-7.11 очистить ДНК.
16. Подготовить лигирование буферной смеси (см. Таблицу материалы).
17. Пипетка 8 мкл лигирование буферной смеси на бусины (от шаг 7.14), 1 мкл адаптер 1 мкм и Ресуспензируйте бисер. Используйте 1 мкл 5 мкм адаптер для ввода образца. Рассмотрите различные адаптеры для каждого образца для мультиплексирования.
18. 1 мкл ДНК лигаза и Инкубируйте 15 мин при 20 ° C.
19. Добавить 1.0 x тома (10 мкл) раствора ПЭГ/NaCl, Ресуспензируйте бисер и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
20. Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
21. Пипетка 25 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
22. Добавьте 1.0 x объем (25 мкл) раствора ПЭГ/NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
23. Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
24. Пипетка 11 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
25. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
26. Соберите супернатант в новой 8-газа ПЦР-пробирку.
27. Подготовка в реальном времени PCR главный микс (см. материалы для подробной информации).
28. Пипетка 8.5 мкл в реальном масштабе времени PCR мастер смеси в 384-ну количественного PCR (ПЦР) плита и добавить 1,5 мкл адаптера лигируют ДНК (от шаг 7.26).
29. Пипетка 10 мкл каждого флуоресцентные стандарта в пустой скважин.
30. Выполнять ПЦР в реальном времени с следующие программы: (98 ° C на 45 s) x 1 цикл, (98 ° C 15 сек, 60 ° C за 30 s, 72 ° C для 30 s) x 20 циклов, и (72 ° C для 60 s) x 1 цикл.
31. Определите количество циклов PCR, необходимых для достижения интенсивности флуоресценции флуоресцентные стандарт 2.
32. Подготовка мастер ПЦР смесь (см. Таблицу материалы).
33. Пипетка 11,5 мкл мастер смесь ПЦР в оставшихся лигируют адаптер ДНК (шаг 7.26) и выполнять ПЦР, как указано в шаге 7.30 с циклами PCR определены в шаге 7.31.
34. Добавьте 1.0 x объем (20 мкл) раствора ПЭГ/NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
35. Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
36. Пипетка 20 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
37. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
38. Соберите супернатант в новой трубки 1,5 мл ДНК низкой привязки.
39. Проверьте качество библиотеки, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2E и F). Используйте 1 мкл пример библиотеки ДНК. (необязательно) Выполните анализ обогащения, ПЦР, как описано выше ². Десятикратное или большего обогащения должны соблюдаться.

8. секвенирование

1. Последовательность библиотек в секвенсор следующего поколения (см. репрезентативных данных, показанный на рисунке 3).
   Примечание: Глубина последовательности, достаточно для анализа данных будет отличаться в зависимости от размера геном организма³. Для человека и мыши, мы рекомендуем получить по крайней мере 20-40 миллионов сингл конце читает. По мнению урожайности гласит мультиплексирование может быть экономически эффективным.

Результаты

Здесь мы описываем рассечение тканей, фиксации, лизис клеток, тандем очистки хроматина, и подготовка библиотеки ДНК для следующего поколения секвенсорами. Во время процедур один можно проверить качество ДНК, которая является ключом к успешной виртуализации, на нескол...

Обсуждение

Наш протокол был оптимизирован для нейронов мозга мыши, в котором выражение с тегами Флаг H2B индуцируется тамоксифен инъекции. Промоутеры, используемые для выражения H2B, исходных материалов ткани и количество тканей являются ключевой параметрами для успешной tChIP след Таким образом опт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region