JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод обеспечивает основу для изучения включения экзогенных жирных кислот из сложных источников хозяина в бактериальные мембраны, в частности золотистый стафилококк. Для этого описаны протоколы для обогащения частиц липопротеинов из куриного яичного желтка и последующего профилирования жирных кислот бактериальными фосфолипидами с использованием масс-спектрометрии.

Аннотация

Золотистый стафилококк и другие грамположительные патогены включают жирные кислоты из окружающей среды в мембранные фосфолипиды. Во время инфекции, большинство экзогенных жирных кислот присутствуют в принимающих частиц липопротеинов. Сохраняется неопределенность в отношении резервуаров жирных кислот-хозяев и механизмов, с помощью которых бактерии извлекают жирные кислоты из частиц липопротеинов. В этой работе мы описываем протоколы для обогащения частиц липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из куриного яичного желтка и определяем, служат ли ЛПНП резервуарами жирных кислот для S. aureus. Этот метод использует объективный липидомный анализ и куриные ЛПНП, эффективную и экономичную модель для исследования взаимодействий между ЛПЛ и бактериями. Анализ интеграции S. aureus экзогенных жирных кислот из ЛПНП проводится с использованием высокой разрешения/точной масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии, что позволяет охарактеризовать состав жирных кислот бактериальной мембраны и объективное выявление новых комбинаций жирных кислот, которые возникают в бактериальных мембранных липидах при воздействии ЛПНП. Эти передовые методы масс-спектрометрии предлагают беспрецедентную перспективу инкорпорации жирных кислот, раскрывая конкретные экзогенные жирные кислоты, включенные в фосфолипиды. Методы, изложенные здесь, адаптируются к изучению других бактериальных патогенов и альтернативных источников сложных жирных кислот.

Введение

Метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) является ведущей причиной инфекции, связанной с здравоохранением, и связанная с этим устойчивость к антибиотикам является значительной клинической проблемой1,2,3. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий является приоритетной задачей. Перспективная стратегия лечения грамположительных патогенов ингибирует синтез жирных кислот, требование для производства мембранного фосфолипида, который, в S. aureus, включает в себя фосфатидилглицерол (ПГ), лисил-ПГ, и кардиолипин4. В бактериях, производство жирных кислот происходит через синтез жирных кислот II путь (FASII)5, который значительно отличается от эукариотического аналога, что делает FASII привлекательной мишенью для развития антибиотиков5,6 . Ингибиторы FASII в первую очередь нацелены наFabI, фермент, необходимый для удлинения углеродной цепи жирных кислот 7. Ингибитор FabI триклозан широко используется в потребительских и медицинских товаров8,9. Дополнительные ингибиторы FabI разрабатываются несколькими фармацевтическими компаниями для лечения инфекции S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Тем не менее, многие грамположительных патогенов, в том числе S. aureus, способны очистки экзогенных жирных кислот для синтеза фосфолипидов, в обход ингибирования FASII27,28,29. Таким образом, клинический потенциал ингибиторов FASII обсуждается из-за значительных пробелов в наших знаниях об источниках жирных кислот-хозяев и механизмах, с помощью которых патогенные микроорганизмы извлекают жирные кислоты из организма27,28. Для устранения этих пробелов мы разработали объективный метод липидомного анализа для мониторинга включения экзогенных жирных кислот из частиц липопротеинов в мембранные фосфолипиды S. aureus.

Во время сепсиса, частицы липопротеинов-хозяев представляют потенциальный источник принимающих жирных кислот в сосудистой, так как большинство принимающих жирных кислот связаны с частицами30. Липопротеины состоят из гидрофильной оболочки, состоящей из фосфолипидов и белков, которые заключают гидрофобное ядро триглицеридов и холестериновых эстеров31. Четыре основных класса липопротеинов - хиломикрон, липопротеин с очень низкой плотностью, липопротеины высокой плотности и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) - производятся хозяином и функционируют как липидные транспортные средства, доставляя жирные кислоты и холестерин в и из клетки-хозяина через сосуды. LDLs в изобилии в эстерифицированных жирных кислот, включая триглицериды и холестерин эфиры31. Ранее мы показали, что высокоочищенные лПЛА человека являются жизнеспособным источником экзогенных жирных кислот для синтеза PG, обеспечивая тем самым механизм для ингибитора FASII шунтирования32. Очистка человека LDLs может быть технически сложной и трудоемкой в то время как коммерческие источники очищенных человека LDLs являются непомерно дорогими для использования на регулярной основе или для выполнения крупномасштабных бактериальных экранов. Для устранения этих ограничений, мы изменили процедуру для обогащения ЛПНП из куриного яичного желтка, богатый источник частиц липопротеинов33. Мы успешно использовали нецелевые, с высоким разрешением / точной масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии для мониторинга включения человека LDL полученных жирных кислот в мембране S. aureus32. В отличие от ранее окоторыхажинных методов, этот подход может количественно изомерить отдельные жирные кислоты для каждого из трех основных типов стафилококковых фосфолипидов. Олеиновая кислота (18:1) является ненасыщенным жирным кислотом, присутствующим во всех частицах липопротеинов- хоста, которые легко включаются в S. aureus phospholipids29,30,32. S. aureus не способен синтезировать олеиновой кислоты29; Таким образом, количество фосфолипид-включенной олеиновой кислоты устанавливает наличие принимающих липопротеинов жирных кислот в стафилококковой мембране29. Эти фосфолипидные виды могут быть идентифицированы по описанному здесь методу масс-спектрометрии, предлагая беспрецедентное разрешение мембранного состава S. aureus, культивируется в присутствии источника жирных кислот, который, скорее всего, может быть встречается во время инфекции.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол для обогащения частиц ЛПНП из куриного яичного желтка получен из Moussa et al. 200233.

1. Приготовление куриного яичного желтка для обогащения частиц ЛПНП

  1. Обезвить два больших куриных яйца, промыв скорлупу с 70% раствор атанола и дайте высохнуть.
  2. Обезврежете яичный сепаратор с помощью 70% раствора этанола и дайте высохнуть. Прикрепите яичный сепаратор на губу стакана среднего размера.
  3. Трещины каждое яйцо индивидуально в яйцо сепаратора и позволяют альбуман течь в стакан. Нетронутый яичный желток будет сохранен сепаратором.
  4. Вымойте яичный желток дважды с 30 мл стерильного фосфатного солей (PBS) для удаления остаточного альбумина.
  5. Аккуратно поместите яичный желток на фильтровальную бумагу.
  6. Проколить вительлинную мембрану стерильным наконечником пипетки и слейте содержимое мембраны в стерильную коническую центрикатную трубку 50 мл. Откажитесь от мембраны и фильтровальной бумаги.

2. Фракция LDL-содержащей плазмы из желтока куриного яйца

  1. Добавить примерно два тома 0,17 M NaCl на рН 7,0 в яичный желток и перемешать энергично. Затем смешайте этот раствор при 4 градусах по Цельсию в течение 60 мин.
  2. Centrifuge разбавления яичного желтка при 10 градусах Цельсия при 10000 х г в течение 45 мин. Удалите плазменную фракцию (супернатант) из гранулированной фракции (гранулы) в стерильную коническую трубку 50 мл.
  3. Повторите шаг 2.2.

3. Изоляция частиц ЛПНП от плазмы

  1. Смешайте плазменную фракцию с 40% сульфатом аммония (w/v) при 4 градусах по Цельсию в течение 60 мин.
  2. Отрегулируйте рН плазменной фракции раствором 420 мМ NaOH до 8,7.
  3. Centrifuge яичный желток разбавления при 4 C при 10000 х г в течение 45 мин. Удалите верхнюю полутвердую желтую фракцию в 7 kDa пор размер диализовых труб. Предоставьте место в трубах, чтобы она набухла.
  4. Диализ на ночь при 4 градусах Цельсия в 3 л ультрачистой воды, чтобы удалить сульфат аммония. Аккуратно агитировать воду с помощью перемешать бар.
  5. Перенос диализированного раствора в стерильную коническую центрифугу 50 мл.
  6. Центрифуги раствор при 4 градусах по Цельсию при 10 000 х г в течение 45 мин. Осторожно удалите верхнюю полутвердую желтую фракцию в стерильную трубку и храните при 4 градусах Цельсия.

4. Оценка куриных ЛПНП как источника жирных кислот

  1. Субкультура S. aureus клетки в 5 мл жирных кислот, свободных 1% бульона триптона и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию с тряской (225 об/ ч. ). Для жирных кислот auxotrophs, дополнить культур с источником жирных кислот.
  2. Разбавить ночные культуры до оптической плотности (OD) на 600 нм (OD600) 0,1 в 1% бульона триптона. Пипетка 50 л клеточной подвески в каждом колодце кругло-нижней 96-колодец пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с жирными кислотами auxotrophs, мыть ночных культур в двух томах бульона триптона и resuspend в 5 мл бульона триптона, чтобы ограничить перенос жирных кислот до определения OD культуры.
  3. Для скважин, содержащих необработанные элементы управления, добавьте 50 кв/л 1% бульона триптона на скважину.
  4. К скважинам, содержащим экспериментальные клеточные суспензии, добавьте 50 кл. 1% бульона из триптона, дополненного 10% яичным желтком LDL, 2 мкм триклозан, или смесь 10% яичного желтка, полученного лПНП и 2 мкм триклозана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, каждая скважина будет содержать 100 КЛ и конечная концентрация яичного желтка полученных ЛПНП и триклозан на скважину будет 5% и 1 мкм, соответственно.
  5. Измерьте OD600 с течением времени, используя микроплитный считыватель, установленный на уровне 37 градусов с непрерывным, линейным встряхиванием для мониторинга роста.

5. Инкубация S. aureus с ЛПНП для мембранного липидного анализа.

  1. Культура изолированной колонии в 5 мл жирных кислот, свободных 1% бульона триптона и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию с тряской (225 об/мин).
  2. Разбавить ночные культуры 1:100 в стерильную 250 мл озадачило колбу, содержащую 50 мл 1% бульона триптона. Инкубировать до середины бревенчатого этапа (примерно 4 ч) при 37 градусах Цельсия при встряхивании.
  3. Перенесите 25 мл культуры в стерильную 50 мл центрифуги трубки и гранулы клеток. Удалите супернатант и resuspend клеточной гранулы в 750 зл и 1% бульона триптона.
  4. Объедините переплетные клетки и аликвот 300 л суспензии клетки в стерильную 1,5 мл центрифуги трубки.
  5. Добавьте ЛДЛ к желаемой конечной концентрации и инкубировать при 37 градусах Цельсия с встряхиванием (225 об/мин) в течение 4 ч.
  6. Centrifuge культур при 4 кв с при 16000 х г в течение 2 мин и мыть клеточные гранулы в двух томах стерильных PBS затем повторить.
  7. Запишите вес каждой влажной клетки гранулы. Прикрепите-заморозить клетки гранулы на сухом льду или в жидком азоте и хранить при -80 градусах по Цельсию или перейти непосредственно к разделу 6.

6. Извлечение липидов Мембраны S. aureus

  1. Поместите замороженные пеллеты S. aureus на сухой лед. Добавьте 0,5 мм оксидные бусы на верхней части каждой клетки гранулы, используя объем бисера примерно равны объему клеточной гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы этому методу липидной экстракции, исследователи могут использовать устоявшиеся Bligh и Dyer или фолч методы для требовательных липидов из бактериальных клеток34.
  2. Добавьте 740 кЛ 75% метанола (класса HPLC), охлажденный до -80 градусов по Цельсию непосредственно к клеточным гранул.
  3. В качестве внутреннего стандарта на 1 мг клеток на 1 мг клеток встраивайте 2 зЛ из 50 м/м димиристоил фосфатиилхолина (подготовленного в метаноле). Закройте пробирку и поместите 1,5 мл центрифуговых трубок, содержащих каждый образец в доступный порт в гомогенизатор ткани Bullet Blender. Гомогенизировать образцы на низкой скорости, установив 2-3, в течение 3 мин.
  4. Визуально проверить образцы на однородность. Если скопления клеток видны, продолжайте гомогенизацию в Bullet Blender с шагом в 2 мин.
  5. Удалите образцы из Bullet Blender и перенесите на химический капот дыма.
  6. Добавьте 270 л хлороформа к каждой пробной трубке. Вихрь образцы энергично в течение 30 мин.
    ВНИМАНИЕ: Хлороформ является возможным канцерогеном.
  7. Centrifuge образцы в скамейке центрифуги до 30 мин при минимуме 2000 х г. Более быстрые скорости могут быть использованы с совместимыми центрифугами труб и продолжительность центрифугирования может быть сокращена до 10 мин.
  8. В химическом капоте дыма, собирать монофазатический супернатант и передачи в новую пробирку, при этом тщательно избегая протеиновых гранул на дне трубки экстракции.
  9. Добавьте 740 кЛ 75% метанола (класс HPLC) и 270 л Л хлороформа в белковые гранулы и повторно извлеките каждый образец, как описано в шагах 6.6-6.8 выше. Объедините супернатант из второго экстракции с ранее собранным супернатантом для каждого образца.
  10. Испаряйте растворители добычи под потоком инертного газа, такого как азот или аргоне, или под вакуумом с помощью центрифуги концентратора (Таблица материалов).
  11. Вымойте сухие экстракты липидов три раза с 1,0 мл водного 10 мм амбонатного раствора и повторно высушить образцы, как в шаге 6.10.
  12. Resuspend сушеные экстракты липидов в подходящих неполярных растворителей, таких как изопропанол. Повторное использование образцов с использованием 20 Лл на 1 мг свежего веса клеток, определяемых в шаге 5.7 В качестве альтернативы, если вес клеточных гранул неизвестен, resuspend образцы в 200 ЗЛ изопропанола и перейти к разделу 7.

7. Анализ липидных профилей S. aureus с использованием высокого разрешения/точной масс-спектрометрии

  1. Перед проведением полного анализа липидов выберите репрезентативные образцы из экспериментальной группы (ы) и проанализируйте их по целому ряду факторов разбавления образцов, чтобы определить диапазоны разбавления образцов, в которых общие концентрации липидов попадают в линейные диапазон реакции детектора для масс-спектрометра, как ранее описано35.
  2. Испаряйте аликвоты каждого экстракта липидов образца, который будет подвергнут липидному анализу, путем высыхания аликвот оведерных под инертным газом или под вакуумом в центрифуге концентратор (Таблица Материалов).
  3. Отпрысните каждый высушенный экстракт липидов в жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) класса изопропанол: метанол (2:1, v:v), содержащий 20 мм мм аммония formate, используя объемы, эквивалентные оптимальному фактору разбавления образцов, как это определено в шаге 7.1.
  4. Для нецелевого анализа липидов образцы могут быть введены непосредственно на платформу с высоким разрешением/точной масс-спектрометрией без использования хроматографии путем инъекций потока или прямого вливания экстрактов35,36. Перенесите разбавленные липидные экстракты, подготовленные в шаге 7.3, на соответствующий флакон автосэмпера или 96-колодую пластину.
  5. Для анализа на основе впрыска потока поместите флаконы autosampler в контролируемый температурой (15 градусов по Цельсию) автосэмпемер системы HPLC, способной к капиллярным/низким потокам приложений, таких как HPLC (Таблица Материалов), оснащенный электронным потоком пропорциональной и системы мониторинга потока.
  6. Заполните резервуары растворителя HPLC с изопропанол класса LC-MS: метанол (2:1, v:v), содержащий 20 мМ аммония formate.
  7. Используя программное обеспечение Agilent Chemstation, запрограммируйте автосэмпемер HPLC для выполнения 5 инъекций образца. Из меню инструмента выберите Set Up Injectorи введите 5.0 в поле объема инъекций. Агрегаты даются в виде микролитров. Убедитесь, что HPLC установлен на изократический поток на уровне 1 зЛ на мин 2:1 (v:v) изопропанол: метанол, содержащий 20 мМ аммония formate.
  8. Из меню Chemstation Instrument выберите Set Up Pump,, а затем выберите переключатель переключателя в режиме Micro Flow.
  9. В полях расписания введите: Время 0.00, 100% B, Поток 1.0. Хит Введите и создать второй ряд в расписании, введя время 10.0, 100% B, Поток 1.0. Выберите кнопку OK в нижней части меню Set Up Pump. Эти параметры позволят 10 аналитических запусков со скоростью потока 1,0 л в минуту.
  10. Ввести элуат из линии передачи HPLC в масс-спектрометр с помощью источника ионизации электроспрея, оснащенного низкоточной (34 G) металлической иглой.
  11. Используя программное обеспечение для управления инструментами Thermo Tune Plus, выберите меню настройки и выберите нагретый источник ESI. Установите напряжение ионизации до 4000 В и газ оболочки до 5 (произвольных единиц), набрав эти значения в соответствующих полях диалоговой коробки. Аналогичным образом, установите капиллярный темп до 150 градусов по Цельсию и S-объектив до 50%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения должны быть оптимизированы для каждой платформы масс-спектрометрии.
  12. Для нецелевого анализа липидов используйте в качестве детектора платформу ms высокого разрешения/точной массы(Таблицаматериалов).
  13. Используя программное обеспечение Thermo Tune Plus, нажмите кнопку Define Scan и в меню Analyzer выберите FTMS. Установите поле Mass Range в нормальное и в поле Разрешения выберите 100 000. Убедитесь, что тип сканирования настроен на полный. В соответствии с меню Scan Ranges, введите 200 в поле Первой массы (м/z) и введите 2000 в поле Last Mass (m/z).
  14. Убедитесь, что отрицательная полярность используется для обнаружения наиболее распространенных S. aureus липидов.
  15. Повторите анализ образца с помощью ионной картографической тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) фрагментации всех ионов липидов в спектральной области, представляющих интерес, для подтверждения липидных структур и компонентов жирных кислот. Кроме того, выбранные липидные ионы, представляющие интерес, могут подвергаться анализу MS/MS после того, как в разделе 8 были назначены первоначальные определения липидов.

8. Поиск базы данных для выявления эндогенных S. aureus и экзогенных липидов, полученных лПНП

  1. Используйте программное обеспечение Thermo Xcalibur для дальнейшего уточнения наблюдаемой точности массы. В Xcalibur, в меню Tools, выберите Recalibrate Offline. После открытия окна Recalibrate Offline загрузите файл массового спектра для перекалибровки, выбрав меню файла и выбрав опцию Open.
  2. Откройте интересуемый файл, переключите кнопку Insert Row в верхней части окна представления, чтобы просмотреть общую хроматограмму иона для запуска MS. Средний приобретенных сигналов MS, нажав на компьютерную мышь на одном краю наблюдаемого пика сигнала в общей ионной хроматограммы и перетаскивая мышь через самую широкую часть пика.
  3. В меню фильтра сканирования выберите фильтр, соответствующий данным MS полного сканирования. Загрузите справочный файл, содержащий теоретические моноизотопные массы, по крайней мере трех известных эндогенных липидов S. aureus, выбрав кнопку Load Ref... Проверьте поле использования рядом с каждой липидной моноизотопной массой.
  4. Нажмите кнопку поиска в нижней части окна просмотра. Повторно ежесредний сигнал MS через пик сигнала в общей ионной хроматограмме, как это было сделано ранее.
  5. Нажмите кнопку Преобразование в нижней части окна просмотра. Когда открывается окно диалога Convert, нажмите OK. Опустите этот шаг, если данные были собраны на платформах масс-спектрометрии от поставщиков, кроме Thermo Scientific.
  6. Используя программное обеспечение Xcalibur, экспортируете перекалиброванные точные пиковые списки массы для каждого необработанного или обработанного ЛПНп образца в отдельные листы файла Excel. Выберите значок браузера qual. Откройте перекалиброванный файл, представляющий интерес, выбрав меню файла и выбрав опцию Open...
  7. Средний сигнал через широкий пик в общей ионной хроматограммы, как описано в шаге 8.2.
  8. Право нажмите значок thumbtack в окне просмотра массового спектра и выберите Просмотр Спектр Список. Из того же меню выберите параметры дисплея, а затем все пики переключают в меню Display. Нажмите кнопку OK, чтобы закрыть окно просмотра.
  9. Право нажмите значок thumbtack в окне просмотра массового спектра снова и выберите Экспорт Клипборд (точная масса). Вставьте экспортируемую ячейку данных A1 первого листа в новую таблицу Excel.
  10. Удалите первые 8 строк текста в экспортируемом файле данных, таким образом, что ячейка A1 электронной таблицы Excel содержит первую точку данных массы из массового спектра. Повторите экспорт каждого перекалиброванного файла MS, используя новый лист в файле Excel для каждого экспортируемого пикового списка.
  11. Используя программное обеспечение Lipid Mass Spectral Analysis (LIMSA)37 Add-In for Excel, постройте базу данных, содержащую молекулярные формулы известных видов липидов S. aureus, описанных Hewelt-Belka et al. 201438, а также формулы, представляющие липидные виды, которые гипотетически могут присутствовать в ЛПНП.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, следует позаботиться о включении потенциальных молекулярных формул в базу данных для гипотетических бактериальных липидов, которые включили основные жирные кислоты ЛПНП, такие как олеиновые (18:1) и линоленовые (18:2) жирные кислоты32.
  12. Чтобы создать базу данных, откройте пустую таблицу Excel. В ячейке А1 первого листа введите теоретическую/вычисленной моноизотопной массе липидных видов, которая должна быть добавлена в базу данных, соответствующую массе липидных видов в ионном состоянии, наблюдаемом в масс-спектрометре. В клетке B1 введите название для липидов видов, таких как PG (34:0).
  13. В клетку С1 введите молекулярную формулу для липидов, соответствующую ионное состояние липида, наблюдаемое в масс-спектрометре. В клетке D1 введите заряд липидов видов, как наблюдается в масс-спектрометре. Перейдите к ячейке A2, чтобы начать новую запись для следующего вида липидов, которые будут введены в базу данных поиска.
  14. Повторяйте шаги 8.12 и 8.13 до тех пор, пока все желаемые виды липидов не будут внесены в базу данных. Сохраните файл базы данных и оставьте его открытым в Excel.
  15. В Excel выберите меню Add-Ins. Выберите LIMSA, чтобы запустить программное обеспечение LIMSA. Из основного меню щелкните кнопку «Библиотека соединения». В новом окне, которое появляется, нажмите импортные соединения. Это позволит загрузить сложную базу данных для использования программным обеспечением LIMSA.
  16. Выполните точную массу липидных идентификаций на всех спектрах MS с помощью программного обеспечения LIMSA Add-In для Excel в соответствии с инструкциями поставщика35. Из основного меню LIMSA выберите список пиков в меню типа «Спектр». Выберите Положительный режим или Отрицательный режим, чтобы соответствовать полярности, в которой были получены данные MS.
  17. В окне Пика fwhm (m/z) введите желаемое окно поиска массы для нахождения пика. Для данных ms MS с высоким разрешением/точной массой рекомендуется окно поиска массовой толерантности 0,003-0,005 м/з.
  18. В окне чувствительности введите желаемое отсечение базового уровне (например, 0,01% относительного изобилия). В меню коррекции изотопов выберите линейные алгоритмы соответствия или вычитания, любой из которых может быть использован с данными пикового списка.
  19. Выделите липидные соединения, чтобы включить в поиск базы данных, нажав на желаемые виды липидов в окне доступных соединений. Нажмите кнопку Добавить, чтобы добавить выделены липидных видов в поисковой группе.
  20. Определите внутренние стандарты, нажав на добавленные соединения, затем изменив окно концентрации на соответствующую концентрацию выбранного внутреннего стандарта.
  21. Убедитесь, что внутренние стандартные и отобранные липидные виды, подающиеся количественной оценке, относятся к одному и тому же названию класса, выбрав каждый добавленный вид липидов и внутренний стандарт и набрав название класса (например, PG или Lipid) в поле класса.
  22. Чтобы сохранить группу липидных соединений для будущего использования, нажмите кнопку «Сохранить» рядом с меню Группы.
  23. Убедитесь, что файл Excel, содержащий все экспортированные пиковые списки MS, открыт для листа, соответствующего первому запуску S. aureus MS, а затем нажмите кнопку поиска из основного меню LIMSA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выход поиска базы данных LIMSA будет включать в себя список масс-спектральных объектов, сопосамых липидов, присутствующих в базе данных, построенных в шагах 8.12-8.13, а также концентрации для каждой соответствующей функции после нормализации до одного или нескольких выбранных внутренних стандартов.
  24. Используйте программное обеспечение Xcalibur для изучения точной массы спектра MS/MS для м/з, соответствующих липидным ионам, представляющим интерес, для подтверждения компонентов жирных кислот, присутствующих в каждом идентифицированном липидном молекулярном виде. Выберите значок браузера qual. Откройте файл MS/MS, представляющий интерес, выбрав меню выпадения файлов и выбрав опцию Open...
  25. Выберите фильтр сканирования, соответствующий анализу MS/MS липидного м/z интереса, нажав на значок thumbtack в окне просмотра массового спектра, и выберите диапазоны из меню. В новом окне, которое появляется, выберите меню фильтра, чтобы выбрать сканирование.
  26. Средний сигнал через общую хроматограмму иона, описанную в шаге 8.2. Используйте программное обеспечение MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) для выполнения соответствующих статистических тестов. Оцените статистически значимую разницу в липидном составе S. aureus путем сравнения нормализованного изобилия липидов в необработанных и обработанных ЛПНП условиях.

Результаты

Протокол для обогащения ЛПНП из куриного яичного желтка иллюстрируется на рисунке 1. Этот процесс начинается с разбавления всего яичного желтка солевом раствором и разделения твердых веществ яичного желтка, называемых гранулами из растворимых или пл?...

Обсуждение

S. aureus включает экзогенные жирные кислоты в мембрану фосфолипидов27,32,43. Синтез фосфолипидов с использованием экзогенных жирных кислот обходит ингибирование FASII, но также изменяет биофизические свойства мембраны27,

Раскрытие информации

Авторы не раскрытии информации.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Hammer за их критическую оценку рукописи и поддержку этой работы. Д-р Алекс Horswill из Университета Колорадо школы медицины любезно при условии AH1263. Доктор Крис Уотерс (Chris Waters Laboratory) из Мичиганского государственного университета предоставил реагенты. Эта работа была поддержана Американской ассоциацией сердца грант 16SDG30170026 и стартовых средств, предоставляемых Мичиганского государственного университета.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium sulfateFisherBP212R-1≥99.5% pure
Cell culture incubatorThermoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plateCorning378896 well
Filter paperSchleicher & Schuell597
Large chicken eggN/AN/ACommon store bought egg
Microplate spectrophotometerBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
S. aureus strain AH1263N/AN/AProvided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubingPierce687007,000 MWCO
TryptoneBecton, Dickison and Company211705
0.5 mm zirconium oxide beadsNext AdvanceZROB05
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24B
Methanol (LC-MS grade)FisherA4561
Chloroform (reagent grade)FisherMCX10559
Isopropanol (LC-MS grade)FisherA4611
Dimyristoyl phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids850345C-25mg
Ammonium bicarbonateSigma9830≥99.5% pure
Ammonium formateSigma70221-25G-F
Xcalibur softwareThermo ScientificOPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometerThermo Scientifichigh resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLCAgilent
SpeedVac Vacuum ConcentratorsThermo Scientific

Ссылки

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены