Интегрированная Рамана спектроскопия и массовая спектрометрия Платформа для изучения одноклеточного потребления наркотиков, метаболизма и эффектов

Резюме

Этот протокол представляет собой интегрированную Рамано-масс-масс-спектрометрию (MS), способную достичь одноклеточного разрешения. Раман спектроскопия может быть использована для изучения клеточной реакции на наркотики, в то время как MS может быть использован для целевого и количественного анализа потребления наркотиков и метаболизма.

Аннотация

Клетки, как известно, по своей сути неоднородны в их ответах на наркотики. Поэтому важно, чтобы одноклеточная неоднородность учитывалась в исследованиях по открытию лекарств. Это может быть достигнуто путем точного измерения множества клеточных взаимодействий между клеткой и препаратом на одноклеточном уровне (т.е. потребление наркотиков, метаболизм и эффект). В этой статье описывается одноклеточная Рамана спектроскопия и масс-спектрометрия (MS) платформа для мониторинга метаболических изменений клеток в ответ на наркотики. Используя эту платформу, метаболические изменения в ответ на препарат могут быть измерены Спомощью Рамановской спектроскопии, в то время как препарат и его метаболит можно количественно оценить с помощью масс-спектрометрии в одной клетке. Полученные результаты свидетельствуют о том, что можно получить доступ к информации об усвоении наркотиков, обмене веществ и реакции на одноклеточном уровне.

Введение

Клетки по-разному реагируют на изменения в их микроокружении на одноклеточном уровне, явлении, называемом клеточной неоднородностью^1. Несмотря на это, текущие исследования открытия наркотиков основаны на средних измерениях популяций клеток, которые запутывают информацию о потенциальных субпопуляциях, а также одноклеточных вариациях^2. Эта недостающая информация может объяснить, почему некоторые клетки более восприимчивы к наркотикам, в то время как другие устойчивы. Интересно, что отсутствие одноклеточной информации о реакции препарата является возможной причиной провала фазы II клинических испытаний препаратов³. Поэтому для решения этой проблемы, клеточные взаимодействия с препаратом (т.е. поглощение, метаболизм, и ответ) должны быть измерены на одноклеточном уровне.

Для достижения этой цели мы разработали уникальную систему, в которой живые одиночные клетки проверяются с помощью безэтикетки Рамана спектроскопии, а затем далее характеризуется с помощью масс-спектрометрии⁴. Раманская спектроскопия обеспечивает молекулярный отпечаток клеточного состояния, сложный спектр в результате вклада многих молекул внутри клетки. Несмотря на эту сложность, можно считать, что отпечатки пальцев Раман отражают структуру всей клетки и метаболизм^5,6. Раманская спектроскопия выделяется при измерении клеточных состояний в неинвазивной и относительно высокой пропускной форме, что делает ее полезной для скрининга и оценки реакции препарата на одноклеточном уровне.

В отличие от этого, MS обеспечивает необходимую чувствительность и селективность для измерения усвоения наркотиков на одноклеточном уровне. Поскольку MS является разрушительным (образец «клетки», как правило, потребляется во время анализа), интеграция его с неразрушающей, без этикетки Ребан спектроскопии может обеспечить высокую пропускную и чувствительную систему. Эта комбинированная платформа способна предоставить больше информации о усвоении наркотиков, метаболизме и эффектах на одноклеточном уровне.

Данная рукопись разъясняет протокол, используемый для изучения клеточных взаимодействий с наркотиками на одноклеточном уровне с использованием культур in vitro с помощью интегрированной платформы Raman-MS. Для этого в качестве модели используются клетки гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) и тамоксифен. HepG2 клетки были выбраны потому, что они занимают тамоксифен и усваивают препарат, и они одновременно страдают из-за его гепатотоксического воздействия. В этой рукописи используются два состояния: клетки, обработанные наркотиками, против необработанных клеток (контроль).

протокол

1. Культура клеток

1. Культурные ячейки, представляющие интерес в соответствующих культурных средствах массовой информации. Пенициллин-стрептомицин может быть добавлен, чтобы избежать загрязнения. В случае клеток HepG2, культурные клетки в культурном носителе, содержащем модифицированную среду Орла (DMEM) Dulbecco, дополнены 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) и 0,1% пенициллина-стрептомицина. Для того чтобы faciltate измерения спектроскопии Raman, клетки можно вырастить на 0.1% gelatin-coated стеклянн-дно тарелку или слайды кварца.
2. Инкубировать клетки в течение 2 дней при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в увлажненный инкубатор.
3. Синхронизация клеточных культур для достижения 70% стоек.
4. Клетки субкультуры в 35 мм стеклянно-нижней сетки блюдо или кварцевые слайды с использованием той же среде при плотности посева 0,7 х 10⁶, а затем инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культура блюда или слайды могут быть предварительно покрыты коллагена или желатина покрытие решение с соотношением поверхности культуры 5 мкг / см^2, чтобы позволить им исправить, обеспечивая их выживание во время измерения.

2. Лечение наркомании

1. Удалить клеточные культуры из инкубатора и вымыть 2x с предварительно разогретым буфером PBS (37 градусов по Цельсию).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимально удалить клетки для медикаментозного лечения при стыке 50%-60%.
2. Разделите клетки на медикаментозные и необработанные подгруппы в 35-мм культурных блюдах.
3. Смешайте препарат выбора с культурой средств массовой информации. Например, растворить тамоксифен в диметилсульфодоксид (DMSO) и смешать с культурой средств массовой информации для получения окончательного объема 2 мл и тамоксифен концентрации 10 мкм. Это будет группа, лечимую наркотиками.
4. Смешайте соответствующий объем растворителя (DMSO) в среду в качестве контроля для изучения влияния DMSO. Это будет контрольная группа.
5. Инкубировать обе группы в 2 мл шипами средств массовой информации подготовлены в шагах 2,3-2,4 на 24 ч. Ожидаемая стоя после инкубации должна состочиться 70%-80%.

3. Раман спектральной визуализации и спектральной обработки

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя Раман спектроскопии системы коммерчески доступны, Раман спектроскопии системы, используемой здесь является самодельным линии сканирования конфокальный микроскоп ранее описано^7,8. Вкратце, эта система оснащена 532 нм диод накачкой твердотельного лазера. Лазерный свет формируется в плоскости с помощью цилиндрической линзы, которая позволяет измерения 400 спектров в одной экспозиции. Раман спектры были записаны с помощью охлажденных CCD камеры, установленной на полихроматор, который использует 1200 канавки / мм решетки для максимизации спектрального разрешения области отпечатков пальцев (от 500-1,800 см^-1). Эта спектральная область содержит высокую плотность частот, характерных для молекул, которые генерируют рассеяние Раман. Также используется объектив для погружения в воду (NA No 0.95). Пространственное разрешение этой системы составляет 300 нм, а спектральное разрешение - 1 см^-1. Для обеспечения выживания клеток в ходе эксперимента используется микрокамерка, закрепленная на моторизованной стадии микроскопа.

1. Перед спектральными измерениями проверьте выравнивание оптики. 50 мкм пинхол может быть использован для проверки того, что пинхол и лазерное положение совпадают точно. Введите спектрофотометр щели, когда сужение как можно больше.
2. Используйте этанол для калибровки спектрофотометра перед каждым экспериментом. Чтобы сделать это, поместите EtOH в стеклянное дно блюдо, измерить спектр при данной интенсивности лазера (измеряется в образце) в течение 1 с, и связать пик известных длин волн⁷.
3. Свести к минимуму интенсивность лазера в образце до 2,4 мВт/м2, чтобы клетки выжили при воздействии лазера.
4. Настройка микрокамеры на 5% CO₂ и 37 градусов по Цельсию.
5. Как только система микроскопа готова, удалите клетки из инкубатора и немедленно промыть клетки 2x с разогретым PBS (37 градусов по Цельсию) буфер, а затем добавить 2 мл разогретого PBS (37 градусов по Цельсию) или DMEM, чтобы повторно приостановить клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как PBS, так и FluoroBrite DMEM-медиа являются достаточными вариантами для измерений спектроскопии Рамана, поскольку они производят минимальный фоновый сигнал.
6. Добавьте 10 кл воды на объектив объективного погружения в воду и деликатно поместите стеклянно-нижнюю клеточное блюдо на сцену микроскопа.
7. Измерьте каждую ячейку, сосредоточив лазерную линию. Время выдержки 15 s в клетку достаточно здесь для того чтобы получить поперечное сечение клетки с ясным сигналом Raman. Зеркало гальвано позволяет сканировать одну клетку или группу клеток в течение нескольких десятков минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокое разрешение полной спектральной визуализации клеток требует больше времени и может привести к фотоповреждению. Здесь клетки измерялись с помощью однолинейного воздействия для получения поперечного сечения каждой клетки. Такой подход является хорошим компромиссом для увеличения пропускной способности и получения достаточной информации для дискриминации ячеек, а также обеспечения жизнеспособности клеток путем ограничения фотоповреждения.

4. Предварительная обработка спектральных данных и многовариантный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная обработка является необходимым шагом до дополнительного анализа для того, чтобы удалить нежелательные технические изменения в спектральных данных. Из-за разнообразия методов и программного обеспечения, исчерпывающий список не может быть предоставлена, и Есть много полезных обзоров, найденных в литературе^7,8. В этом разделе мы кратко описываем подход, используемый для анализа и интерпретации спектральных данных Раман, полученных из живых одиночных клеток.

1. Извлекайте и предварительно обрабатывают изображения Раман для удаления возможных помех космических лучей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральная ось спектра, полученных в разные дни/недели/месяцы, может включать некоторые вариации из-за небольших технических вариаций при калибровке с использованием этанола. Это сильно повлияет на последующие многовариантные анализы и статистические сопоставления. В случае, если эксперименты проводятся в течение различных недель/месяцев, ожидаются небольшие оптические вариации. В этом случае данные должны быть интерполированы для исправления возможных спектральных сдвигов данных в экспериментах. Здесь используется интерполяция с использованием кубического сплайна. После этого шага вся ось спектра должна быть выровнена. Для последующего анализа рассматривается диапазон 500-1800 см^-1.
2. Извлекайте спектральные данные клеток и фона (отсутствие клеток) из каждого изображения с помощью домашнего алгоритма. Вычесть фоновый сигнал из сигнала ячейки. Затем усреднените спектры оставшихся пикселей, которые должны соответствовать одной ячейке. Следующие шаги выполняются с использованием 2D спектров клеток.
3. Выполните базовую коррекцию с помощью ModPoly⁹ или любого другого алгоритма, который, по ее оценкам, соответствует достаточно. Обрезать спектральный диапазон до 600-1700 см^-1, чтобы выбрать область отпечатков пальцев и убедитесь, что нет нежелательных эффектов края на спектры из-за плохой полиномиальной установки.
4. Выполните шаг нормализации, такой как нормализация вектора (интенсивность на каждой волновой численности делится на глобальную норму l2 или максимальное сингулярное значение спектра) для нормализации спектральной интенсивности^10,хотя можно считать и другие нормализации.
5. Подготовьте набор данных с соответствующей меткой для каждого класса/условия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнительный спектральный анализ может быть perfored для изучения характера возможных различий между классом клеток / условиями (например, путем вычитания среднего спектра контрольной группы другим группам для выявления регионов, представляющих интерес (таких как потенциальные биомаркеры). Расчеты баллов ANOVA и Fisher также могут быть^{выполнены 10}.
6. Для выявления обработанных и необработанных клеток на основе спектральных особенностей можно применять многовариантные анализы. В качестве набора обучаемых данных следует использовать нормализованные спектральные данные, а неизвестный набор данных (без метки) из эксперимента репликации следует использовать в качестве тестовых данных, если это возможно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дискриминационный анализ, выполненный на некоторых векторах анализа основных компонентов (PCA-DA^10),проекция на скрытые оценки с последующим дискриминационным анализом (PLS-DA), и машины поддержки векторных (SVM)¹¹ являются моделями, часто используемыми в этой области, и каждая из них представляет различные статистические соображения. Предварительная обработка данных должна быть выполнена в связи с этим.
7. Используйте машинное обучение, которое соответствует экспериментальным целям. Здесь проекция на спотовую структуру (PLS) модель построена с использованием спектральной области отпечатков пальцев Раман спектры (600-1,710 см^-1)^11,12. Средний центр данных по мере необходимости. Для перекрестной проверки модели могут применяться различные методы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь применяется венецианская слепая перекрестная проверка с 10 сплитами. Сложность модели (количество компонентов или спотовая переменная) должна быть проверена таким образом, чтобы лучшая модель минимизировать значение исходной средней квадратной ошибки (RMSE). Было установлено, что три скрытых вектора (LVs) обеспечивают наилучшую дискриминацию с нашим набором данных.
8. Определите, какие спектральные пики Раман способствуют дискриминации клеток (например, путем построения оценки переменной важности в проекции (VIP) для каждого волнового числа Раман или величины коэффициента регрессии).
   ПРИМЕЧАНИЕ: VIP-оценка переменной рассчитывается как взвешенная сумма квадратной корреляции между компонентами PLS-DA и исходной переменной. Подробную информацию об алгоритме PLS и VIP баллов можно найти в литературе^11,12.

5. Одноклеточная настройка выборки и процедуры

1. Исправить систему выборки клеток на рамановый микроскоп, как показано на рисунке 1. Подключите 3D-мипулипулитор к стеклянному держателю капилляра, который крепится к пустому шприцу для сосания образца, применяя отрицательное давление(рисунок 1).
2. Установите микроскоп на поле высокого увеличения (40x), чтобы наблюдать за кончиком стеклянного капилляра и убедиться, что он не сломан. Контролируйте положение стеклянного капилляра с помощью микроманипулятора (x-, y-, z-axes). Убедитесь, что капиллярный наконечник по центру в поле зрения, а затем переместить капилляр вверх по оси z, чтобы дать клиренс для культуры блюдо позже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроотбор клеток выполняется стеклянным капилляром для клеток диаметром от 10-15 мкм. Рекомендуется капилляр с отверстием размером 5 мкм. Если размер скважины слишком мал, кончик капилляра будет подключен к клетке, и если он слишком велик, чувствительность более поздних измерений MS может быть скомпрометирована.
3. Поместите образец пластины / блюдо на стадии микроскопа, настроить увеличение и фокус, выбрать целевую ячейку на сетке блюдо, и переместить его в центр зрения. Затем осторожно опустите стеклянный капилляр с помощью микроманипулятора (z-оси) до тех пор, пока кончик не вступит в фокус.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не двигайте капиллярв в x- и y-axes до тех пор пока капилляр не будет в фокусе.
4. Под микроскопическим наблюдением коснитесь целевую одну ячейку с капиллярным наконечником, а затем начните применять отрицательное давление с помощью шприца, чтобы поймать клетку внутри капиллярного наконечника. Запишите эту процедуру, взяв фото или видео, чтобы проверить время и всасывается расположение ячейки точно, если это необходимо.
5. Переместите капилляр на оси z. Затем отсоедините капилляр от капиллярного держателя с помощью щипц в рамках подготовки к анализу MS.

6. Измерения масс-спектрометрии

1. Калибровать точность массы прибора MS в соответствии с рекомендациями производителя. После калибровки убедитесь, что массовая ошибка не превышает 3 промилле.
2. Оптимизируйте инструмент MS до параметров, которые лучше всего подходят для поиска интересов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае тамоксифена и 4-OHT анализа, параметры прибора установлены следующим образом: температура капилляра впуска: 400 градусов по Цельсию, напряжение спрея: 1500 В, автоматическая цель усиления (AGC): 5.00E-06, уровень S-объектива RF: 90%, диапазон SIM: 347-397 м/з, SIM максимальное время впрыска: 200 мс, разрешение SIM: 140 000 FWHM, диапазон MS/MS: 50-400 м/z, цель MS/MS AGC: 2.00E-05, MS/MS максимальное время впрыска: 100 мс, MS/MS разрешение: 17,500 FWHM, MS/MS изоляция: 1 м/з.
3. Настройте автоматический метод приобретения с продолжительностью 5 минут для SIM-режима для достижения относительной количественной оценки, а другой метод MS/MS для положительной идентификации препарата и его метаболита. Параметры метода приобретения должны быть установлены на оптимизированные значения, упомянутые в шаге 6.2.
4. Подготовьте растворитель ионизации под капотом дыма. Состав растворителя зависит от прогноза интереса. Здесь используемый органический растворитель состоит из 80% MeOH, 10% DMSO и 0,1% для метакислоты.
5. До начала измерений смешайте соответствующий внутренний стандарт с органическим растворителем. В этом эксперименте в качестве внутреннего стандарта используется 5,31 нМ d5-тамоксифена.
6. Чтобы избежать ложных срабатываний, аспирировать средства массовой информации, окружающие клетки, обработанные препаратом с помощью 1 мкм отверстие размера капилляра с постоянным микроскопическим наблюдением, чтобы избежать отбора проб любых клеточных частей.
7. Добавьте 2 злитролога растворителя ионизации к широкому концу капилляра, содержащего носитель, используя пипетку, прикрепленную к наконечникам погрузчика. Затем проанализируйте отобранные носители по MS, проверьте наличие анализа интереса (обычно его не следует обнаруживать).
8. Добавьте 2 Зл растворителя ионизации в капилляр, содержащий клетку, зафиксируйте капилляр ный адаптер наноэлектроспрепа (nano-ESI), подключенный к подходящему масс-спектрометру, и начните автоматический метод приобретения.

7. Обработка и анализ данных масс-спектрометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Любое подходящее программное обеспечение может быть использовано для выполнения анализа данных. Однако, если исследователи хотят провести анализ данных с помощью программного обеспечения, которое не предоставляется поставщиком MS, то исходные данные должны быть преобразованы из формата запатентованного поставщика в открытый формат или в качестве текстового файла в первую очередь (что было сделано здесь).

1. Нормализовать данные путем деления пиковой области анализа интереса (ы) на внутренний стандарт от того же сканирования MS. Затем журнал преобразует пиковые соотношения, чтобы уменьшить перекос.
2. Участок нормализованной интенсивности препарата или его метаболита, как квадратный участок или кривой плотности, чтобы визуализировать распределение между одиночными клетками. Здесь используется программное обеспечение R, а также пакет ggplot2.
3. Рассчитайте метаболизированный препарат до неметаболизированного лекарственного соотношения, разделив обилие метаболита препарата на неметаболизированную родительскую молекулу в каждой клетке (т.е. 4-OHT и тамоксифен, соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция между вариациями конкретных пиков Раман интерес и вариации в MS пики препарата или его метаболитов могут быть изучены. Это дополнение к возможной корреляции между самим препаратом и его метаболитом в одиночных клетках. Это можно сделать путем расчета коэффициента корреляции Пирсона с помощью двуххвостого теста. Следует также рассмотреть более продвинутые интеграционные подходы.

Результаты

Одноклеточный анализ лекарственных взаимодействий (поглощение, обмен веществ и эффекты) имеет важное значение для выявления каких-либо скрытых или лекарственно-устойчивых субпопуляции, а также понимание последствий клеточной неоднородности. В этом протоколе были использованы два дополнительных метода для измерения вышеупомянутых взаимодействий в одиночных клетках: спектроскопия Раман и спектрометрия MS. З.Раман быстро определяет клетки, пораженные препаратами на основе спектральных биомаркеров ответных препаратов. MS используется для мониторинга поглощения и метаболизма препарата в селективной и полуколичественной основе. Клетки были сначала проверены Рамане спектроскопии затем индивидуально отобраны для анализа MS.

Сравнительный анализ среднего спектра каждого состояния (с и без лечения) показан на рисунке 2. Усредненные спектры этих двух условий четко различаются на различных пиках, которые ранее были определены и назначены молекулярным соединениям^2. В частности, пики на 1000 см^- (присужденные к ароматическим соединениям, таким как фенилаланин и тирозин) показывают сильные различия. Значимость статистической разницы следует оценивать с помощью дальнейших многовариантных анализов.

Набор данных затем использовался для обучения модели PLS (шаги 4.5-4.8), направленной на различение двух клеточных процедур (с препаратом: n No 290, без препарата: n No 115). Прогностические способности классифицировать клетки, культивированные в присутствии тамоксифена, достигли 100% чувствительности и 72% специфичности в тестовых данных (неизвестных по перекрестной проверенной обученной модели). Чувствительность является мерой истинных положительных моментов, которые правильно определены моделью, в то время как специфичность является мерой фактических негативов, которые определены моделью. Альтернативные модели, такие как SVMs, LDAs и нейронные сети могут обеспечить аналогичные или лучшие результаты, хотя всестороннее сравнение не было выполнено в данном исследовании.

На основе модели PLS были рассчитаны VIP-оценки, которые отражают важность длин волн (Роман сдвиги) в распознавании экспериментальных условий(рисунок 3). Важно отметить, что самые высокие пики VIP-профилей соответствовали пикам Рамана, для которых были замечены сильные различия между двумя процедурами. Это подтвердило специфические молекулярные различия между обработанными и необработанными клетками. Следовательно, исследователи могут определить возможные спектральные биомаркеры, которые отражают реакцию отдельных клеток на медикаментозное лечение. Эти биомаркеры могут быть проверены для дальнейшего тестирования их биологической значимости и обобщения в различных условиях и клеточных линиях.

Система живой одноклеточной масс-спектрометрии (LSC-MS) смогла обнаружить как препарат, так и его метаболиты в отдельных, обработанных наркотиками клетках HepG2, которые ранее измерялись раманой спектроскопией. Кроме того, тандем MS может быть использован для подтверждения структуры обеих молекул. После положительной идентификации, относительное изобилие препарата и его метаболитов были измерены в каждой клетке и сравнены с фоновыми пиками в необработанных клетках. Сильные изменения наблюдались в изобилии тамоксифена, и это явление было еще более выраженным в случае его метаболита, 4-OHT (Рисунок 4). Была также изучена взаимосвязь между изобилием тамоксифена и его метаболитами, в которой была обнаружена значительная положительная корреляция между ними (р- 0,54, стр. 0,0001, n no 31).

Рисунок 1: Система сбора ячеек, установленная на стадии микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Средний спектр наркологических клеток (с тамоксифеном: n No 295) и необработанных клеток (без тамоксифена: n no 115). Вершины Рамына можно определить по литературе. Большинство сильных спектральных различий являются статистически значимыми (ANOVA, р 0,5), как описано ранее⁴. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: VIP-оценки, извлеченные из прогностической модели PLS. VIP-оценки отражают длины волн, которые способствуют различению двух классов в модели. Большинство пиков соответствуют определенным молекулам, которые наблюдаются как спектральные биомаркеры лекарственного воздействия на клетки, обработанные наркотиками. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Распределение изобилия тамоксифена и его метаболита. Распределение изобилия тамоксифена и его метаболита, 4-OHT (измеряется на одноклеточном уровне) по сравнению с эндогенными пиками в необработанных клетках (контроль). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

В этой рукописи был выбран простой случай, в котором клетки HepG2 были выставлены (или нет) для тамоксифена. Показано способность Раманеспектроскопии и системы масс-спектрометрии контролировать воздействие тамоксифена на клетки. Раманская спектроскопия позволила выявить потенциальные биомаркеры, отражающие общую реакцию отдельных клеток на воздействие наркотиков. Наблюдалась определенная неоднородность между одиночными клетками, что свидетельствует о том, что некоторые клетки не реагируют на воздействие наркотиков. С другой стороны, LSC-MS был способен проводить целенаправленный анализ препарата и его метаболита на одноклеточном уровне, при котором в препарате наблюдалась высокая степень неоднородности и его содержание метаболита. Эта неоднородность помогает объяснить, почему некоторые клетки страдают от наркотиков, а другие, казалось бы, нет, несмотря на клетки, происходящие из якобы равномерной населения¹².

Среди конкретных аспектов этого метода, которые требуют внимания, важно оценить качество настройки микроскопа и обработки сигналов для обеспечения воспроизводимости данных. Если предварительная обработка спектра выполняется тщательно, вариации сигнала должны быть максимально максимизированы на локальном максимуме каждого пика. В отличие от этого, базовый уклад и край спектра должны перекрываться между условиями исследуемых ячеек. Другим важным аспектом является многоварная модель, используемая для исследования различий между методами лечения. Необходимо тщательно оценить модели и параметры модели, чтобы обеспечить точный и точный анализ. Одним из преимуществ модели PLS, в отличие от нейронных сетей, является то, что она позволяет получить доступ к весам, связанным с каждой длиной волны (СдвигаМи Рамына), которые лучше всего различают условия, проверенные моделью.

Несмотря на то, что раманская спектроскопия успешно дискриминирует реакцию препарата, следует подчеркнуть, что этот метод ограничен в использовании для обеспечения биологической интерпретации. В основном это связано со сложностью спектрального сигнала, который включает в себя смесь тысяч молекул. Поэтому необходимо провести дальнейшее исследование для оценки систематических различий между спектральной интенсивностью Раман и вариациями концентрации наркотиков. Кроме того, аналогичные исследования других клеточных линий необходимы для оценки обобщения спектральных биомаркеров, связанных с тамоксифеном.

Кроме того, может быть интересно проводить измерения живых тканей для оценки фармакодинамики и изучения того, как наркотики проникают и текут в каждой клетке. Кроме того, следует отметить, что этап выборки в LSC-MS в высокой степени зависит от квалификации оператора. Параметры, такие как пространственное разрешение, положение клеток внутри капилляра после отбора проб, и прочность пропускной силы полностью зависят от оператора, что ограничивает широкомасштабное внедрение LSC-MS. Хотя автоматизированные системы отбора проб могут облегчить эту проблему. Кроме того, в то время как LSC-MS выделяется на выборки приверженцев или плавающих клеток в их родных штатах, он выполняет более плохо в клетках выборки встроенных в секции тканей. Это связано с тенденцией отбора капилляров разорвать, если плотность образца высока. Таким образом, другой подход, такой как один зонд может быть более подходящим в таких случаях^14,15.

Поскольку используемые здесь ячейки пробы взяты в условиях окружающей среды с минимальной подготовкой образца, LSC-MS может быть легко интегрирован с другими технологиями, о чем свидетельствует его интеграция с Раманом в этом протоколе. Еще одна подобная интеграция с 3D голографией позволила достичь абсолютной количественной оценки клеточных метаболитов на субклеточном уровне^16. Кроме того, интеграция с цитометрией потока позволила обнаружить метаболические биомаркеры в отдельных циркулирующих опухолевых клетках больных раком нейробластомы^17,18.

В будущем, в связи с недавним растущим интересом к объединению наборов данных из методов визуализации^19,может также представлять интерес изучение систематических различий между рамаными сигналами и результатами масс-спектрометрии (а также другими методами омики) с помощью интегративных вычислительных подходов. Интересно, что мы уже нашли несколько слабых, но значительных линейных корреляций между интенсивностью пиков Раман определены VIP баллов и обилие тамоксифена или его метаболита на одноклеточном уровне, как определено MS⁴. Эти данные могут свидетельствовать о метаболической взаимосвязи между профилями MS и спектрами Раман и возможности предсказать эти значения.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% penicillin-streptomycin	Nacalai Tesque	09367-34
35mm glass bottom grid dish	Matsunami
4-Hydroxy Tamoxifen standard	Sigma-Aldrich	94873
532 nm diode pumped solid-state laser	Ventus, Laser Quantum
BIOS-L101T-S motorized microscope stage	OptoSigma
CT-2 cellomics coated sampling capillaries	HUMANIX
d5-Tamoxifen standard	Cambridge Isotope Laboratories
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade	Nacalai Tesque	D8418
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Sigma-Aldrich	D5796
Eppendorf GELoader tips	Eppendorf
fetal bovine serum	Hyclone laboratories	SH3006603
FluoroBrite DMEM	Thermo Fisher Scientific
Formic acid LC-MS grade	Sigma-Aldrich	33015
HepG2 cell line (RCB1886)	RIKEN cell bank center	RCB1886
MC0-19A1C Incubator	Sanyo Electric Co.	MC0-19A1C
Methanol LC-MS grade	Sigma-Aldrich	1060352500
MMO-203 3-D Micromanipulator	Narshige	MMO-203
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens	Olympus
Nanoflex nano-ESI adaptor	Thermo Fisher Scientific	ES071
On-stage incubator	ibidi
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution	Thermo Fisher Scientific	88323
PIXIS BR400 cooled CCD camera	Princeton Instruments
Q-Exactive Orbitrap	Thermo Fisher Scientific
Rat-tail collagen coating solution	Cell Applications Inc.
Tamoxifen standard	Sigma-Aldrich	85256