Электроуттинг на основе цифровой микрофлюидной платформы для автоматизированного фермента связанных Иммуносорбент Ассей

Резюме

Электроуттинг на основе цифровой микрофлюидной является методом, который использует напряжение инициативе изменения в явном угол контакта микролитр-объем капли для облегчения его манипуляции. Сочетание этого с функционализированными магнитными бусинами позволяет интегрировать несколько лабораторных операций блока для подготовки образцов и идентификации патогенных микроорганизмов с использованием фермент-связанных Иммуносорбент Ассай (ELISA).

Аннотация

Электроутоктинг – это эффект, при котором изменяется угол контакта капли, подвергаемый поверхностному заряду. Электроутоктинг-на-диэлектрической (EWOD) использует диэлектрические свойства тонких изоляционных пленок для повышения плотности заряда и, следовательно, повысить эффект электроутирования. Наличие зарядов приводит к электрически индуцированному распространению капли, что позволяет целенаправленно ею манипулировать по гидрофобной поверхности. Здесь мы демонстрируем протокол на основе EWOD для обработки и обнаружения четырех категорий антигенов, используя автоматизированную платформу активации поверхности, с помощью двух вариаций ферментно-связанных иммуносорбентных асссе (ELISA). ELISA выполняется на магнитных бусинах с обездвиженные первичные антитела, которые могут быть выбраны для целевой конкретный антиген. Антитела, спряченные с HRP, связываются с антигеном и смешиваются с H₂O₂/Luminol для количественной оценки захваченных патогенов. Были достигнуты сроки завершения асса в размере от 6 до 10 мин, в то время как были использованы мизерные объемы реагентов.

Введение

Предлагаемый метод направлен на облегчение автоматизированной подготовки образцов для ELISA с количественным обнаружением антигенов с использованием ewOD-подхода с цифровыми микрофлюидами (DMF) и магнитофорным разделением. Было продемонстрировано для нескольких биологических приложений, что DMF в сочетании с магнитофорезом является интересной альтернативой жидкости обработки приложений¹. В частности, выявление патогенных микроорганизмов является неявным аспектом во многих секторах, начиная от здравоохранения² в сельском хозяйстве и окружающей среды^3,4 для национальной безопасности⁵. Технология обнаружения, способная устранять угрозы от патогенных микроорганизмов, должна иметь высокую пропускную способность (например, короткое время асссе), эффективность (низкий предел обнаружения - LoD - и высокая чувствительность) и специфичность (к типу целевого патогена) для того, чтобы быть функциональным⁶.

Ранее, EWOD основе DMF была успешно реализована для обратной транскрипции Полимеразы цепной реакции (RT-PCR), обнаружение устойчивых к антибиотикам патогенов (метициллин-резистентный золотистый стафилококк или MRSA), М.пневмония и C.albicans с использованием низкобюджетной, печатной цепи чипа и магнитофореза⁷. Метод был применен также для обнаружения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) мутаций через пиросекевенцию и хемилюминесцентное обнаружение⁸. Платформы на основе EWOD также расширяют свою функциональность в сторону иммуноанализовых приложений, что позволяет одновременно восстанавливать и обнаруживать образец в рамках единой интегрированной платформы. Например, один EWOD-чип дизайн был успешно продемонстрирован с платформой DMF для точки-оф-медицинского тестирования для обоих бисера на основе иммуноанализа сердечного тропонина I из целого образца крови и в качестве отдельного эксперимента RT-PCR для обнаружения MRSA². Этот чип использует масляный наполнитель, который предотвращает испарение капель и облегчает надежное автоматизированное манипулирование объемами нанолитров. Универсальные биоприменения были исследованы с реализацией аналогичных подходов DMF, охватывающих количественные однородные и неоднородные иммуноанализы^9,10 в том числе дизайн экспериментов (DoE) исследования для проверки параметр оптимизации¹¹.

Несмотря на свои очевидные достоинства для обработки интенсификации из-за незначительных объемов работы, заполненная нефтью платформа DMF может быть сложной и требует определенного уровня знаний для работы. Заполненные нефтью системы, поскольку они требуют герметичной составляющей, не являются идеальными для некоторых видов применения в поле, где транспортируемость системы имеет важное значение. Кроме того, на основе нефти система будет очень трудно, если не невозможно использовать для некоторых конкретных приложений, воспользовавшись сухой сбор материала на поверхности, такие, как предложенные Чжао и Чо¹², Янссон-Нидзишка и др.¹³, и Foat и др.¹⁴. В отличие от этого, системы, свободные от масла, просты в интеграции и имеют преимущество, обеспечивая легкий перевод образцов от чипов к чипу. По этим причинам был разработан предлагаемый метод для обеспечения иммуноанализна на основе EWOD на DMF, который не требует масла, эффективно упрощая работу устройства.

В этом вкладе мы сообщаем об использовании индивидуальной, автономной, полностью автоматизированной платформы DMF для иммуноанализов, и мы подробно остраиваем протокол для быстрого обнаружения биомолекул, а именно: белки, вегетативные бактерии, бактериальные споры и вирусы. Комбинация EWOD-чипа с магнитными частицами для автоматизированной подготовки образца и иммунопрецициции была продемонстрирована уже с дополнительным автономным измерением MS^15. Недавно, в поле диагностики против кори и краснухи IgG была продемонстрирована в отдаленных Северо-Западной Кении населения Уилер группы¹⁶. Оба Уилер и наша система, будучи транспортируемым, автономным, полностью автоматизированы с включенными на чипе, в режиме реального времени химилуминесцентных измерений, возможно, одним из самых передовых dMF биообнаружения систем.

Эти две системы были разработаны с очень разными приложениями в виду. Система Уилера нацелена на биомаркер, чтобы позволить биомедицинской диагностики пациентов в то время как наша система биообнаружения построена вокруг оборонных требований для прямого обнаружения патогена, ранее отобранного из воздуха. Сходство между ними является основополагающим принципом активации капель, который демонстрирует широкий спектр секторов, влияющих на жизнь, на которые может повлиять технология на основе EWOD. А именно, платформа обнаружения на основе DMF и связанная с ней система EWOD могут найти ключевое значение в области здравоохранения (биомедицинская диагностика); военная и гражданская защита (обнаружение угроз); Агротехнологии (мониторинг сельскохозяйственных культур) и безопасность труда (мониторинг окружающей среды)

Производительность нашей платформы DMF оценивается на фоне полностью автоматизированного обнаружения человеческого сывороточного альбумина (HSA, шаровый белок), Escherichia coli (E. coli, вегетативные бактерии), Bacillus atrophaeus (BG, бактериальная спорина) и MS2 (бактериофаг). Что еще более важно, предлагаемый метод DMF является чрезвычайно универсальным в том смысле, что захват антител может быть обменна для целевого обнаружения других антигенов отличается от четырех, которые рассматриваются в этой статье. Обход антител на основе зондирования полностью, платформа DMF может построить для потенциального приложения, основанного на aptamer биозондирования, где магнитные бусы нести конкретные aptamers для захвата и / или обнаружения нуклеотидов. Конструкция и реализация различных компонентов, составляющих интегрированную, полностью автономную платформу DMF, включая генератор высоковольтной формы волн и приводную электронику, раскрывается в другом месте⁶.

протокол

1. Предварительные шаги, необходимые для проверки

ПРИМЕЧАНИЕ (IMPORTANT): Все предварительные шаги должны быть проведены в стерильной среде, чтобы избежать загрязнения. Азидея натрия не должна использоваться для хранения, так как он будет препятствовать активности фермента пероксидазы хрена (HRP).

1. Подготовка работает буфер (100 мм HEPES, рН 7,5), используя (4-(2-гидроксиэтил) piperazine-1-этанесульфоновой кислоты, и добавить Tween 80 до концентрации 0,01% (v/v).
2. Обездвижить первичные антитела (захват антител) на поверхность активированных ГСЗ магнитных микробусов, следуя протоколу, предоставленному поставщиком. Кратко, Протокол Магнитного IP/Co-IP Kit(Таблица материалов)включает следующие шаги.
   1. Aliquot 0,2 мл бисера (2 мг) в пластиковую трубку и удалить супернатант.
   2. Вымойте бисер, добавив 1 мл ледяной 1 мМ HCl.
   3. Свяжите выбранное антитело (Анти-человеческий сывороточный альбомный альбом ,15C7), Rb anti-BG polyclonal, Rb anti-E.coli MRE 162 polyclonal или Goat anti-MS2 polyclonal), 40 мкг/мл в 67 мм Борате Буфер, ковалентно к бусинам на 1 ч с тряской при 37 градусах Цельсия. Таблица 1 содержит список всех антител, используемых с текущим протоколом и антигенных патогенов⁶.
   4. Вымойте несвязанные антитела дважды с 0,8 мл Elution Buffer.
   5. Утолить реакцию 1 мл утоления буфера на 1 ч.
   6. Вымойте бусины один раз с модифицированным буфером борате и один раз с IP Lysis/Wash Buffer.
   7. Приготовьшарики в 0,5 мл IP Lysis/Wash Buffer и храните при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока не потребуются для использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов, свежая партия микробусов соединены с антителами за день до EWOD-изоляции и ELISA на чипе. Тем не менее, микробусы в сочетании с первичным антителом могут храниться при 4 градусах Цельсия до одного месяца. Если агломерация происходит, нажмите флакон, чтобы сломать осадок и повторно приостановить бисер в растворе.
   8. Блок микробусы с соединенных антител на ночь, используя окончательную концентрацию 4 мг /мл для микробусов, в Блокировщик Казеин (1% ж / V) в 100 мМ фосфат-буферный солин (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий шаг всегда проводится за день до запуска биообнаружения.
   9. Отделить бусы от Блокатора Casein с помощью магнита и удалить супернатант.
   10. Отдохните в 1 мл бегового буфера и перемешайте в течение 1 мин.
   11. Разделите бусины с помощью магнита и удалите супернатант.
   12. Повторите вышеприведенные шаги стирки (1.2.10 и 1.2.11) дважды.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Три стирки достаточно, чтобы уменьшить сливбий бисера на поверхность и облегчить свободное движение капли.
   13. Приготовьте бусины в бегущий буфер с концентрацией 2,5 мг/мл. Это решение microbeads готов к использованию с чипом EWOD.
3. Подготовьте раствор нейтравидина, конъюгированного пероксидазы хрена (HRP) и вторичного биотинилапопротого антитела к конечной концентрации для каждого из 1 мкг/мл в Бегущем буфере (используется для обнаружения BG^6).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для целевой антигенов (Таблица 1) различные концентрации вторичных биотинилаповых антител, в диапазоне от 0,5 до 4,0 мкг /мл были успешно протестированы.
4. Смешайте равные объемы Luminol с раствором перекиси водорода непосредственно перед запуском ассеиума
   ПРИМЕЧАНИЕ: Luminol используется для количественной оценки числа связывающих событий на основе фермента HRP, который связан ковалентно к вторичному антителу, который нацелен на антиген (например, патоген). Тем не менее, различные молекулы отчетности и стратегии могут быть использованы для обнаружения¹⁷ вместо хемилюминесценции и люминола.

2. Производство и поверхностная обработка компонентов чипов EWOD

ПРИМЕЧАНИЕ: Чип EWOD состоит из пластины активации с узорчатыми электродами хрома, чтобы чередовать видимый угол контакта капли и крышку пластины для определения высоты капель.

1. Нарисуйте дизайн электродов и разъемов в 2D с помощью стандартного программного обеспечения CAD. Включите также площадку для сбора отходов с размерами 5 х 5 мм² для хранения использованных растворителей(рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для управления каплями мы используем 47 электродов, каждый с размерами 1,7 х 1,7 мм². Этот размер электрода вмещает объемы капель в диапазоне от 1,5 до 3 л (для зазора в 500 мкм). По опыту, при работе с 500 мкм разрыв, 1,5 юл является минимальный размер капли, которые могут быть actuated. Это примерно соответствует капле (прогнозируемому) контуру, ограниченному квадратной площадкой. Тем не менее, нет никаких теоретических ограничений в размерах, кроме вызванных сопротивлением (трение) тела жидкости. Тем не менее, рекомендуется, чтобы объем не превышал 3 зл для надежного активации с использованием 500 мкм разрыв. Электроды адресованы 48-канальной электронике.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры конструкции и размеры колодок могут варьироваться в зависимости от предполагаемых объемов и операций лабораторных подразделений (LUOs), составляющих протокол.
2. Отправьте чертеж дизайна в службу по производству масок для печати хромовой маски на стеклянный субстрат. Толщина хромового слоя составляет 100 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слой хрома на фотомаске, используемой в качестве субстрата для чипа EWOD, по определению, непрозрачный. Конструкция каждого из наших электродов включает в себя компоновку сетки для обеспечения полупрозрачности.
3. Разрежьте пластину до размера 56 х 56 мм² с точностью CNC Dicing/Cutting Saw.
4. Stick липкой лентой над электрическими контактами для того, чтобы изолировать их в течение двух шагов покрытия.
5. Пальто пластины хром-стекло пластины с диэлектрическим слоем, откладывая 6 мкм Parylene-C на его поверхность. Процесс Gorham¹⁸ используется с 7,4 г DPX-C в системе осаждения парилена(Таблица материалов).
6. Спин-шерсть аморфных фторполимеров(Таблица материалов) с помощью спин-пальто на 1500 об/мин в течение 30 с на вершине пластины и выпекать его при температуре 140 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это делает поверхность гидрофобной. Можно проверить, было ли покрытие отложено успешно путем размещения капли воды на поверхность. Угол контакта между каплей и пластиной должен находиться в районе 110o.
7. Удалите липкую ленту из электрических контактов.
8. Спин-шерсть аморфных фторполимеров(Таблица материалов) с помощью спин-пальто на 1500 об/мин на 30 с на вершине 4-в кремниевой пластины и выпекать его при температуре 140 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы обе поверхности актуации и крышка пластины гидрофобные для того, чтобы облегчить плавное движение дискретных капель во время проверки.

3. Загрузка, сборка и эксплуатация чипа EWOD на платформе DMF

ПРИМЕЧАНИЕ: Чип EWOD работает с использованием параллельной конфигурации пластины с точно определенным разрывом 0,5 мм между актуационной пластиной и проводящую, заземленую крышку пластины. Эта сборка сэндвичей описана в текущем разделе.

1. Снимите крышку с платформы DMF⁶ и поместите ее на скамейку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Темная камера клетки Фарадея, необходима для предотвращения бродячего света и электромагнитных помех во время обнаружения. На крышке нет блокировки, следовательно, платформа позволяет наблюдать за движением капель.
2. Поместите чистую актуационную пластину на вращающуюся стадию, хром, обращенный вверх. Пластина должна быть выровнена с верхним левым углом утопленной стадии(рисунок 2А).
3. Зажим наячку сверху с помощью панели с 47 контактными контактными штырями. Это обеспечивает пластину на место и облегчает выравнивание с контактными контактными штырями.
4. Положите 0,5 мм шими и 2 мм полиметилметакрилат (PMMA) сепаратор на вращающейся стадии, для того, чтобы обеспечить контролируемый разрыв между активацией и крышкой пластин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, wicking бумага может быть помещена на площадку для удаления отходов до aliquoting капель до следующего шага. По мере того как ассс идет, отходы сразу поглощены в бумагу которая может быть извлекана на конце асссы.
5. Загрузите капли на предлагаемые погрузочные площадки(рисунок 1).
   1. Aliquot четыре капли 2,5-Л из буфера Running на B-, A-, R-, E-обозначенные колодки, по одной капле на каждой площадке.
   2. Раствор Aliquot 2.5 л Люминола:H₂O₂ (1:1, v/v) раствор на D-обозначенную площадку.
   3. Aliquot 2.5 л нейтравидина спрягнет с HRP (1 мкг/мл) на обозначеную F-обозначаетемую площадку.
   4. Aliquot 2.5 л биотинилатированных вторичных антител (1 мкг/мл) на G-обозначенную площадку.
   5. Aliquot 2.5 л микробусов с конъюгированными первичными антителами (2,5 мг/мл) переходят на обозначенную I-площадку.
   6. Aliquot 2.5 л неизвестного образца на C-обозначенную площадку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемый шаблон загрузки является лишь одним из примеров экспериментального макета, однако, шаблон загрузки может быть изменен в соответствии с потребностями пользователей, до тех пор, как эти изменения соответствуют последовательности, определенной в программном обеспечении(Дополнительный файл 1).
6. Поместите крышку пластины на поверхности буровой установки, помимо круглой области углубления, и сдвиньте его боковой в углубление и на верхней части актуационной пластины(Рисунок 2B).
7. Положите постоянный магнит на верхней части крышки пластины и закрепите его, сдвинув две защелки(рисунок 2C).
8. Поверните сцену на 180 градусов и визуально проинспектируйте, если загруженные капли все еще на месте(рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нужно уметь глазное яблоко положение и форму капель через прозрачную стадию и заднюю часть актуационной пластины (Рисунок 2D). Ассеи готов к запуску, если на верхней части погрузочных электродных колодок можно увидеть круглые капли. В случае, если капля смещена, можно удалить магнит и крышку пластины, затем восстановить смещенную капельку с чистой пипеткой и поместить ее снова на погрузочную площадку.
9. Убедитесь, что позиция загрузки для каждой капли соответствует запрограммированной последовательности активации в программном обеспечении (см. Дополнительный файл 1 для получения подробной информации о программном обеспечении).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы иметь возможность визуально проверить положение капель, фотодетектор должен быть демонтирован(рисунок 2D).
10. Расположите отсеченный фотодетектор "может" в слот вращающейся стадии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система фотообнаружения поворачивается вокруг фотодиода, который имеет большую площадь сбора (10 х 10 мм²), чтобы максимизировать сбор света без дополнительной оптики, а также транс-импеданс усилитель, чтобы свести к минимуму шум⁶. Тем не менее, система чрезвычайно чувствительна и может собирать минутные сигналы. Для снижения уровня шума был реализован ряд стратегий на основе электроники (например, система фотообнаружения была защищена, поместив ее в клетку Фарадея, металлический корпус, известный как экранированный "может").
11. Подключите кабель к фотодетектору, экранированному "может".
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как чип EWOD приведен в соответствие с фотодетектором, платформа DMF полностью собрана и теперь готова к работе.
12. Поместите крышку над платформой DMF и начните программную последовательность с помощью программного интерфейса, разработанного в Университете Хартфордшира.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительное программное обеспечение используется для чтения и записи люминесценции из капли в качестве функции времени в файле CSV (см. Дополнительный файл 2).
    1. Убедитесь, что запрограммированная последовательность (см. Дополнительный файл 1) быстрые сообщения появляются в интерфейсе, чтобы сообщить оператору, что "капли светила готов собирать извлеченные магнитные бусы" или "Капля обнаружения готова к перемещению на место обнаружения". В обоих случаях требуется подтверждение от оператора, чтобы продолжить последовательность.

4. Работа в визуальном режиме (необязательно для оптимизации протоколов)

ПРИМЕЧАНИЕ: При желании, для визуализации каждой операции на основе капли, ассс можно управлять, пропуская шаги 3.10-3.12 и заменяя их следующими операциями.

1. Начните программную последовательность с помощью программного интерфейса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Движение капель можно наблюдать во время работы в визуальном режиме, что полезно при оптимизации протокола. Во-первых, чтобы проверить воспроизводимость операции магнитного разделения. Например, если количество используемых шариков слишком низкое, магнитное разделение не произойдет, наоборот, если количество бисера слишком велико, капля может быть обездвижена шариком. Во-вторых, для установления надежности нового ассеа, поскольку некоторые формулировки капель могут вызвать нарушение активации, которые могут быть обнаружены путем наблюдения.
2. Установите фотодетектор экранированный "может" в щель вращающейся стадии, когда предложено.
3. Подключите кабель к фотодетектору экранированного "может", вставив булавки в розетку.
4. Поместите крышку над платформой DMF и возобновите ассоциат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дополнительное программное обеспечение для чтения и записи люминесценции от капли в качестве функции времени в файле CSV (см. Дополнительный файл 2)

5. Удаление жидких отходов и очистка чипа

ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что оборудование выключено и отключено от источников питания (компьютер, основной) до очистки. Носите перчатки, лабораторное пальто и очки защитное стекло (PPE) при удалении биологических образцов из чипа!

1. Чтобы получить доступ к электродам и использованным растворителям на актуационной пластине, откройте крышку платформы DMF и поверните сцену на 180 градусов.
2. Отстегните магнитную оболочку, снимите магнит с вращающейся сцены и поместите его на скамейку.
3. Снимите крышку пластины, кремниевую пластину, из щели с помощью пары пинцета, промойте ее водой DI, высушите ее сжатым воздухом и поместите в чашку Петри, где можно хранить и повторно использовать.
4. Используйте микропайпет для перемещения жидких отходов со площадки, не касаясь поверхности.
5. Очистите поверхность, свалив жидкость из актуациальной пластины с помощью абсорбирующей бумаги (фильтровального материала).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение поверхности нетронутыми увеличит долговечность пластины активации, что позволяет несколько применений.
6. Очистите актуационную пластину, аккуратно подметая поверхность электродов чистой капелькой DI с помощью чистого пипетки. Затем удалите капли с фитильной бумагой (фильтрующим материалом).
   ВНИМАНИЕ: Распоряжаться тканями, бумагами, пипетками и перчатками, загрязненными биологическим материалом, в мусорное ведро.
7. Используйте пластину активации для другого ассоциирования или удалите ее с платформы DMF для хранения или переработки.

Результаты

Влияние напряжения активации было исследовано для того, чтобы выяснить, какие оптимальные условия были для выполнения анализов. Капля из буфера была загнана при различных напряжениях привода, и ее движение было записано. Полученные результаты показали(Рисунок 3) корреляция существовала между корневым средним квадратным напряжением активации (V_rms)и средней скоростью. Тем не менее, долговечность актуационной пластины была снижена, когда высокие значения для V_rms были использованы. На основе этих результатов, 105 V_rms был выбран в качестве стандартного напряжения активации, 120 V_rms было установлено, что лучше всего работать для H₂O₂/ Luminol капли и 165 V_rms была реализована для добычи LUO. Эти напряжения были включены в автоматизированную последовательность программирования(Дополнительный файл 1).

Два иммуноанализов(рисунок 4) были успешно протестированы с помощью чипа EWOD с платформой DMF для четырех различных патогенных микроорганизмов(таблица 1). Чип EWOD способствовал последовательному перемещению капель с погрузочных колодок в область смешивания и, наконец, в отходы. Существовали два основных LUOs, которые были повторены в течение протокола для завершения ELISA. Первым была добыча ЛУО; Кратко описано здесь, капля, содержащая подвешенные бусы был доставлен в место разделения в середине зоны смешивания, магнит был активирован автоматически, чтобы приблизиться к чипу и объединить магнитные бусы в гранулы (Рисунок 5). Затем капля была перемещена в сторону мусоросовестной площадки, оставив бусинки на актуационной пластине, тем самым заключив добычу LUO. Смешивание было следующим ключевым LUO состоится на чипе EWOD. Анализный образец с неизвестной концентрацией патогенов был перенесен на бисер путем электроутирования. Затем бисер были resuspended путем перемещения капли с слипшимися бусинами по области смешивания (10 колодок в общей сложности). Эти два LUOs были необходимы, поскольку они способствовали миниатюрной, быстрой и воспроизводимой обработки образцов с последовательным обнаружением патогенных микроорганизмов в 6-10 мин. На рисунке 6 показана полная последовательность ЛУО от иммуноанализ, выполненный с чипом EWOD.

Для достижения желаемого уровня автоматизации могут быть введены изменения в протоколе. Например, бусы отделялись от выпадающих капель антигена, которые затем передавались на мусорную площадку, повторяя основную добычу ЛУО. На данном этапе, протокол может ветвиться в зависимости от того, обнаружение антитела была сопряжена с HRP уже, эффективно используя восемь LUOs в общей сложности для обнаружения различных антигенов(Рисунок 7A-C). В этих случаях капли с обнаружением антитела были доставлены в бисер, а затем смешаны путем активации. Кроме того, привязка обнаружения антитела к Neutravidin-HRP конъюгированный может быть выполнена последовательно на месте на чипе EWOD, как это было продемонстрировано для количественной оценки кишечной палочки (Рисунок 7D). Оба протокола, восьми- и десятиступенчатой ELISA(рисунок 4), дали воспроизводимое обнаружение антигенов.

Время инкубации и конъюгации концентрации были разнообразны, чтобы найти экспериментально оптимальные условия для проведения асссе(рисунок 7A). Было установлено, что инкубационное время 160 с и конъюгированная концентрация 2 мкг/мл достигли наилучшего соотношения сигнала к шуму с 36% увеличением силы сигнала и практически без изменений в уровнях фонового шума. Все цифры и данные, используемые в разделе репрезентативных результатов, были изменены по более ранней работе⁶.

Первичное / Захват антитела	Обнаружение антител	Антигена
Анти-человеческий сывороточный альбомин (анти-HSA, Abcam ab10241)	Лошадь Редька Peroxidase (HRP) помечены анти-HSA (Abcam ab24438)	Человеческий сывороточный альбомин (HSA, Abcam)
Rb анти-BG поликлональный	Биотинилатированный Rb анти-BG поликлональный	Споры B. globigii (BG)
Rb анти-E.coli MRE 162 поликлональный	Биотинилатированный Rb анти-E.coli 162 MRE поликлональный	E. coli MRE 162
Коза анти-MS2 поликлональный	Биотинилатированный Rb анти-MS2 поликлональный	Вирус бактериофага MS2

Таблица 1: Антигены и антитела, проверенные этим протоколом. Для демонстрации возможностей чипа EWOD с платформой DMF были использованы четыре типа патогенных антигенов.

Рисунок 1: Дизайн пластины EWOD. () Схематическая нотация пластины активации EWOD с разъемами (квадратами, сверху), которые связаны (линии) с электродами (квадраты, нижний). Каждая колодка присваивается номер и может быть адресована из программного кода(Дополнительный файл 1). Погрузочные электродные колодки отмечены стрелками и обозначаются заглавными буквами выше или ниже каждой колодки. Ключевой особенностью платформы DMF является зона микширования, состоящая из десяти колодок (No 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). В качестве визуального руководства зона смешивания отмечена красным прямоугольником. (b)Микрограф микросетки колодки дизайн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Компоненты и ключевые этапы сборки цифровой микрофлюидной системы (DMF). (A) Исправьте пластину активации EWOD, поместите шерстяную шерстью на вращающуюся стадию и загрузите капли. (B) Расположите крышку. (C) Смонтировать корпус магнита, закрепить защелки и вращать сцену 180 ". (D) Автоматизированный магнит указывает вниз. Проинспектировать положение и форму капель, проверить, что печатная плата (PCB) булавки выровнены с контактами на чипе EWOD, подключить фотодетектор и поместить его в слот для фотодетекторов. После подключения электроники управления к компьютеру, система готова к запуску ассеа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Повторное использование актуационных пластин и влияние на напряжение активации. Средняя скорость капли из бегущего буфера построена как функция напряжения активации (синие круги) и стандартного отклонения от трех независимых измерений (N No 3). Здесь количество анализов на пластину (серые полосы) указывает на усиление распада поверхности при более высоких напряжениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Диаграмма иммуноанализов, протестированных с помощью EWOD. Каждый круг на этой диаграмме представляет собой объем 2,5 л, загруженный на чип EWOD. Первый протокол (на левой стороне) показывает восемь LUOs с использованием предварительно смешанных антител-HRP конъюгировать; в то время как второй протокол включает в себя десять LUOs, отдельно добавляя биотинилаповые антитела обнаружения, извлечения бисины и последовательный связывание Neutravidin-HRP сопряжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Добыча магнитного биса. Этот процесс разбивается на (a-c) активации капли с взвешенными магнитными бусинами в магнитном месте разделения в середине зоны смешения (площадка No 33), (d, e) магнит движется в положение фокусировки бисера, (f, g, h) бусы удерживаются на месте магнитной силой в то время как капля действует прочь EWOD отходов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Полная последовательность иммуноанализов с использованием EWOD, показывающая реагенты, погрузку образцов и операции лабораторных подразделений. Каждая строка содержит последовательность образов изображений из характерных операций на капле. Операции делятся на столбцы. Смешивание не выполняется для бисера в подвеске, представленной черной сломанной линией. Направления капли обозначены синими стрелками, бусы выделены на одном из изображений оранжевой стрелкой. Серая коробка (нижний правый угол) отделяет два изображения, которые представляют движение и положение в области обнаружения, круг сломанной линии выделяет область обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Кривые калибровки из иммуноанализов, проводимых на чипе EWOD с платформой DMF. Как сообщалось^{ранее, 6} выходных напряжений (мВ) по сравнению с концентрациями показаны для: (A) Человеческий сывороточный альбомин, который используется для изучения эффекта концентрации конъюгированных антител (C) и времени инкубации, т_inc, измеренный от смешивания бисера с известным анализом до извлечения LUO, (B) B. atrophaeus (BG) спор, показывающий воспроизводимость иммунораса, (C) MS2 бактериофаг иммунотерапевта, и (протокол) E. coli. Аббревиатуры: колоний формирования единиц (cfu), бляшки формирования единиц (pfu), количество независимых экспериментов (N), лабораторное отделение операции (LUO). Рисунок изменен из предыдущей публикации⁶. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Полная последовательность для запуска платформы DMF для автоматизированного анализа ELISA с Neutravidin-HRP в качестве конъюгированного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Графический интерфейс для измерения химилюминесценции и пример из измерения с программным обеспечением показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Протокол иммуноанализа EWOD является гибким и может включать в себя различные различные операции лабораторных подразделений (например, захват антигена, смешивание, инкубация, извлечение бисины, мытье) в зависимости от типа реагента, стабильности и использования требований, определенных протоколом ассировки. В качестве доказательства принципа, в текущей статье, два протокола иммуноанализ считается показ реализации восьми или десяти LUOs(Рисунок 4) с чипом EWOD описано. Такая миниатюризация заслуживает от микролитра, дискретных объемов реагентов/анализа, которые повышают эффективность ELISA за счет сокращения как потребления реагентов, времени, требуемого для операции, по сути, общего экспериментального времени (от 6 до 10 мин). Кроме того, анализ автоматизирован с приурочен манипуляции капель, что уменьшает вариации и улучшает точность иммуноанализ¹⁷. В своем нынешнем формате эксперимент включает в себя ручную обработку капель в начале каждого асссе, что является точкой для дальнейшего обсуждения в следующем разделе.

Одним из важнейших шагов в текущем методе DMF является распределение капель на поверхность чипа EWOD. Как правило, микропипетец с одноразовым наконечником используется для измерения точного объема и его загрузки. Тем не менее, это может стать сложной задачей, чтобы обездвижить капли на гидрофобной поверхности актуационной пластины из-за взаимодействия между каплями и заряженной поверхности одноразового наконечника. В результате, капля может стрелять вверх после внешней поверхности кончика, а не оставаясь на пластине. Чтобы избежать этого, микропайпет должен быть проведен в вертикальном положении, перпендикулярно поверхности чипа, не касаясь его, то капля может быть отпущена на погрузочную площадку, в результате чего его в контакт есот поверхности. Если капля прилипает к наконечнику пипетки, верните его в биржевой раствор, обменяйте наконечник и пересадите новую каплю. В ходе дальнейшего развития нынешней системы проверки концепции можно предусмотреть автоматическую доставку капель.

Другим важным шагом, прежде чем запустить ассс, является закрытие крышки параллельной сборки пластины. Как указано ранее в протоколе, крышка должна быть скользнула поверх актуационного пластины. Гидрофобная поверхность крышки предотвращает искажение и смещение капель, сидящих на актуационной пластине. Чтобы гарантировать плавное движение капли, настоятельно рекомендуется использовать нетронутую актуационную пластину, правильную загрузку капель и сборку чипов. Возможна повторное использование актуационных пластин; однако, количество циклов зависит от напряжения активации(рисунок 3)и осаждения аналита/реагента на поверхность, ака биофолинг. Представленная платформа использовала хромированный чип EWOD, который можно было надежно использовать для последовательных измерений до четырех раз при рабочем напряжении 120 В и промежуточной очистке пластин после каждого эксперимента. Плиты были переработаны, чтобы уменьшить стоимость за эксперимент, путем обеззараживания (щеткой поверхности с неразбавленным очистительным агентом перед тщательной промывкой) биофолированных аморфных фторполимеров(Таблица материалов) покрытие и спин-покрытие свежий на верхней части пластины. Однако для рециркуляции актуационных пластин требуется ручная обработка, дорогостоящие реагенты (аморфные фторполимеры(Таблица материалов))и специализированное оборудование (спин-пальто). Альтернативные чипы EWOD успешно исследуются с помощью экономически эффективных субстратов, таких как бумага^19,ацетатные пленки или печатные плат (ПХД)^20,21. Такие одноразовые расходные материалы могут способствовать надежному и доступному использованию платформы DMF и могут служить средством для обойти проблему биофолинга.

Биофолирование является основным ограничением EWOD для биологических применений^22,23. Более ранние исследования по DMF определили два механизма, которые способствуют биофоллинга, а именно, пассивная адсорбция из-за гидрофобных взаимодействий, и электростатически управляемый адсорбции проявляется, когда электрическое поле применяется²⁴. Выводы в текущей статье согласуются с этой теорией, как было документально активации пластины повторного использования уменьшается при высоком напряжении активации. Одним из возможных объяснений является то, что белки адсорбировать легко на фторполимер покрытием (тефлоновые) поверхностей, и они агрегируют быстрее на загрязненных по сравнению с нетронутой поверхностей²⁴. Как следствие, связанные с белками анализы на DMF трудно количественно и могут испытывать потерю анализ, перекрестное загрязнение и снижение точности¹⁷. Наихудший сценарий, когда критическое количество белка адсорбты, таким образом, делает устройство бесполезным. Чтобы свести к минимуму биофоллинг, различные подходы были исследованы от минимизации времени пребывания капли на чипе, через покрытия²³, до добавок (т.е. сурфактантов или плуронной кислоты) в биоматериал-Ладена капель^6,22. Поэтому важным аспектом анализа иммуноанализа на EWOD является выбор стратегий по борьбе с биофоллингом, которые совместимы с конкретным протоколом.

Автоматизированная платформа DMF предназначена для выполнения одного теста ELISA сэндвича за пробег при использовании микролитровых объемов как для реагентов, так и для анализа. Когда это необходимо, обычные наборы сэндвич ELISA существуют на основе предварительно покрытием 96-наилучшим образом или 384-ну пластин, которые в сочетании с вспомогательным лабораторным оборудованием приводят к более высокой пропускной записи на пробег; исходя только по цене реагентов, примерная стоимость за асса/хорошо составляет 6,04 usd (580 USD/96) и 0,33 USD (2-580 USD/384) соответственно. Это делает традиционные методы ELISA идеальными для большого числа образцов, обработанных, как правило, квалифицированным техническим персоналом на централизованных лабораторных объектах. Однако в отдаленных районах подробный анализ затрат ELISA на экологический мониторинг показал, что, когда капитальные затраты (т.е. расходы на лабораторную эксплуатацию, периодические расходы, транспортировку образцов, принадлежности и персонал) включали фактическую цену за ELISA в размере 60 долларов США, из которых 34 доллара США составляли поставки на одну пробу^25. В отличие от этого, предлагаемая платформа DMF является портативной, требует минимальной подготовки для работы и с предварительно покрытыми бусинами может обеспечить анализ от быта к ответу в считанные минуты. Таким образом, представленная технология может быть развернута в пунктах нуждаемых мест и дополнять анализы, в противном случае доступные в централизованных лабораториях.

В разделе репрезентативных результатов для прямого обнаружения патогенных микроорганизмов для применения в обороне использовалась автоматизированная платформа иммуноанализов DMF. Другие возможные приложения для платформы DMF охватывают, но не ограничиваются, биодиагностика, непрерывный мониторинг и автоматизированная выборка. Потенциально DMF может повлиять на различные сектора от точки-оф-медицинской помощи для персонализированного здравоохранения, а также контролируемый мониторинг окружающей среды для защиты пациентов от воздушно-капельной инфекции, к системе мониторинга урожая для сельского хозяйства и производства продуктов питания.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.