자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

요약

전기 습윤 기반 디지털 미세 유체는 마이크로 리터 볼륨 액적의 명백한 접촉 각도에서 전압 구동 변화를 활용하여 조작을 용이하게하는 기술입니다. 이를 기능화된 자기 비드와 결합하면 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 병원균의 시료 준비 및 식별을 위한 여러 실험실 단위 작업의 통합이 가능합니다.

초록

전기습은 표면 전하에 노출된 액적의 접촉각이 수정되는 효과이다. 전기습식 온 유전체(EWOD)는 박단 절연체 필름의 유전체 특성을 활용하여 전하 밀도를 향상시키고 따라서 전기 습윤 효과를 향상시킵니다. 전하의 존재는 소수성 표면에 걸쳐 의도적 인 조작을 허용하는 물방울의 전기유도 확산을 초래한다. 여기에서, 우리는 효소 연결된 면역 흡착 분석 (ELISA) 방법의 2개의 변이를 통해 자동화된 표면 작동 플랫폼을 사용하여 항원의 4개의 종류, 견본 처리 그리고 검출을 위한 EWOD 기지를 둔 프로토콜을 보여줍니다. ELISA는 특정 항원을 표적으로 하기 위하여 선택될 수 있는 고정화된 1 차적인 항체를 가진 자기 구슬에 행해진다. HRP에 공액된 항체는 항원과 결합하고 포획된 병원체의 정량화를 위해_H2O2/루미놀과 혼합된다. 6~10분의 분석 완료 시간이 달성되었으며, 소량의 시약이 활용되었습니다.

서문

제안된 방법은 디지털 미세 유체학 (DMF) 및 자성 분리를 가진 EWOD 기지를 둔 접근을 사용하여 항원의 정량적인 검출을 가진 ELISA를 위한 자동화한 견본 준비를 촉진하는 것을 목표로 합니다. 그것은 자성 관증과 함께 DMF액체 처리 응용 프로그램에 대한 흥미로운 대안이다 여러 생물학적 응용 프로그램에 대한 입증되었다^1. 보다 구체적으로, 병원균의 검출은 헬스케어^2에서 농업 및 환경^3,4, 국가 안보^5에이르기까지 많은 분야에서 암시적 측면이다. 병원균으로부터의 위협을 해결할 수 있는 검출 기술은 높은 처리량(예를 들어 짧은 분석 시간), 효율성(낮은 검출 한계 – LoD – 및 고감도) 및 특이성(표적 병원체 유형에 대한)을^특징으로하여 6.

이전에는 EWOD 기반 DMF가 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR), 항생제 내성 병원균(메티실린 내성 황색포도상구균 또는 MRSA), M.pneumonia 및 C.albicans의 저예산 인쇄 회로 기판 칩 및 자력세포에대해 성공적으로 구현되었습니다. 이 기술은 또한 열화상 및 케밀발광 검출을 통한 데옥시리보핵산(DNA) 돌연변이의 검출을 위해 서도 적용되었다^8. EWOD 기반 플랫폼은 또한 면역 분석 애플리케이션으로 기능을 확장하여 단일 통합 플랫폼 내에서 동시 시료 회수 및 검출을 가능하게 합니다. 예를 들어, 단일 EWOD 칩 설계는 전체 혈액 샘플에서 심장 트로포닌 I의 비드 기반 면역 분석과 MRSA^검출을위한 별도의 실험 RT-PCR로서 DMF 플랫폼으로 성공적으로 입증되었습니다. 이 칩은 오일 필러를 사용하여 액적의 증발을 방지하고 나노리터 부피의 신뢰할 수 있는 자동 조작을 용이하게 합니다. 다목적 생체 응용분야는 분석 파라미터 최적화를 위한 실험(DoE) 연구의 설계를 포함하여 정량적 균질성 및 이종^{면역분석제 9,10을} 포함하는 유사한 DMF 접근법의 구현으로 조사되었다^11.

작업량이 적기 때문에 강화를 처리하는 명백한 장점에도 불구하고 오일이 채워진 DMF 플랫폼은 어려울 수 있으며 운영하려면 일정 수준의 전문 지식이 필요합니다. 밀폐된 부품이 필요하기 때문에 오일 충전 시스템은 시스템 운송성이 중요한 특정 현장 응용 분야에적합하지 않습니다. 또한, 오일 기반 시스템은 자오 및 조^12,욘손-니에드지오와프카 et al.^13,및 Foat et al.^14에의해 제안된 것과 같은 표면에 건조 물질 수집을 이용하는 일부 특정 애플리케이션에 사용하기가 불가능하지 않다면 매우 어려울 것이다. 반면, 오일 프리 시스템은 통합이 간편하며 칩 간 샘플 변환을 쉽게 제공할 수 있다는 장점이 있습니다. 이러한 이유로, 제안된 방법은 오일을 필요로 하지 않는 DMF상에서 EWOD 기반 면역분석법을 제공하기 위해 개발되었으며, 효과적으로 장치 작동을 단순화하였다.

이 기여에서, 우리는 면역 분석에 대한 맞춤형, 독립형, 완전 자동화 된 DMF 플랫폼을 사용하는 것에 대해 보고하고, 우리는 생체 분자의 신속한 검출을위한 프로토콜, 즉 단백질, 식물성 박테리아, 박테리아 포자 및 바이러스를 정교하게합니다. 자동화된 시료 전처리 및 면역 침전을 위한 자기 입자와 EWOD 칩의 조합은 이미 추가적인 오프라인 MS 측정^15로입증되었습니다. 최근, 홍역과 풍진 IgG에 대한 현장 진단은 휠러 그룹^16에의해 원격 노스 웨스턴 케냐의 인구에서 입증되었다. 휠러와 우리의 시스템 모두, 수송, 독립적 인, 포함 된 온칩, 실시간 화학 발광 측정은 틀림없이 사용할 수있는 가장 진보 된 DMF 바이오 검출 시스템 중 하나입니다.

두 시스템은 매우 다른 응용 프로그램을 염두에 두고 설계되었습니다. 휠러의 시스템은 환자에 대한 생체 의학 진단을 허용하는 바이오 마커를 대상으로 하는 반면, 당사의 생체 검출 시스템은 이전에 공기에서 샘플링된 병원균을 직접 검출하기 위한 방어 요구 사항을 중심으로 구축되었습니다. 둘 사이의 유사성은 EWOD 기반 기술이 영향을 미칠 수있는 생명에 영향을 미치는 광범위한 분야를 보여주는 액적 작동의 기본 원리입니다. 즉, DMF 기반 검출 플랫폼 및 관련 EWOD 시스템은 건강(생물 의학 진단)에 중요한 영향을 줄 수 있습니다. 군사 및 민간 보호(위협 탐지); 농업 기술 (작물 모니터링) 및 작업 안전 (제어 환경 모니터링)

우리의 DMF 플랫폼의 성능은 인간 혈청 알부민 (HSA, 구형 단백질), 대장균 (대장균,식물성 박테리아), 바실러스 영양 (BG,세균 포자) 및 MS2 (박테리오파지 바이러스)의 완전 자동화 된 검출에 대해 평가됩니다. 더 중요한 것은, 제안된 DMF-method는 포획 항체가 본 문서에서 고려되는 4가지와 다른 다른 항원들의 검출을 표적으로 하기 위해 교환될 수 있다는 점에서 매우 다재다능하다. 항체 기반 감지를 완전히 회피하는 DMF 플랫폼은 자기 비드가 뉴클레오티드의 포획 및/또는 검출을 위해 특정 aptamers를 운반하는 압타머 바이오센싱을 기반으로 잠재적인 응용 분야에 구축할 수 있습니다. 고전압 파형 발생기 및 구동 전자장치를 포함하는 통합된 완전 독립형 DMF 플랫폼을 구성하는 상이한 구성요소의 설계 및 실현은 다른 곳에서 개시된다^6.

프로토콜

1. 분석에 필요한 예비 단계

참고(중요): 오염을 방지하기 위해 모든 예비 단계는 멸균 환경에서 수행되어야 합니다. 아지드 나트륨은 고추냉이 과산화효소(HRP) 효소의 활성을 저해할 수 있으므로 저장에 사용해서는 안 된다.

1. 러닝 버퍼(100 mM HEPES, pH 7.5)를 준비하고, (4-(2-하이드록세틸) 피페라진-1-에탄설포닉산을 사용하고, 트웬 80을 0.01%(v/v)의 농도로 첨가한다.
2. 공급 업체가 제공하는 프로토콜에 따라 NHS 활성화 자기 마이크로 비드의 표면에 1 차 항체 (포획 항체)를 고정시. 간단히, 자기 IP /공동 IP 키트(재료의 표)프로토콜은 다음 단계를 포함합니다.
   1. 비드 0.2 mL(2 mg)을 플라스틱 튜브에 넣고 상류를 제거한다.
   2. 얼음 차가운 1 mM HCl의 1 mL을 추가하여 구슬을 씻는다.
   3. 선택된 항체(항인간 혈청 알부민[15C7], Rb 항-BG 폴리클로날, Rb항-대장균 MRE 162 폴리클로날 또는 염소 항-MS2 폴리클로날), 40 μg/mL을 67 mM 의 보레이트 버퍼, 37°C에서 흔들림으로 1시간 동안 구슬에 공유한다. 표 1은 현재 프로토콜 및 항원 병원체와 함께 사용되는 모든 항체의 리스트를 포함한다^6.
   4. 0.8 mL의 용출 완충제로 언바운드 항체를 두 번 세척합니다.
   5. 1 시간 동안 담금질 버퍼의 1 mL로 반응을 담금질하십시오.
   6. 수정된 붕산염 버퍼로 구슬을 한 번 씻고 IP Lysis/워시 버퍼로 한 번 세척합니다.
   7. IP 용해/세척 버퍼의 0.5 mL에 구슬을 다시 일시 중단하고 사용이 필요할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
      참고: 최상의 결과를 위해, 새로운 마이크로비드 배치는 EWOD 격리 및 ELISA 온칩 전날 항체에 결합됩니다. 그러나, 1차 항체에 결합된 마이크로비드는 4°C에서 최대 1개월까지 저장할 수 있다. 응집이 발생하면 바이알을 탭하여 침전물을 부수고 용액의 구슬을 다시 일시 중단합니다.
   8. 100 mMM 인산 완충 식염수 (PBS)에서 차단카제인 (1 % w / v)에서 마이크로 비드에 대한 최종 농도 4 mg / mL을 사용하여 밤새 결합 된 항체로 마이크로 비드를 차단합니다.
      참고: 차단 단계는 항상 생체 검출 분석 실행 전날 실시됩니다.
   9. 자석을 사용하여 차단카제인에서 구슬을 분리하고 상류제를 제거합니다.
   10. 실행 버퍼의 1 mL에서 다시 일시 중단하고 1 분 동안 혼합합니다.
   11. 자석을 사용하여 구슬을 분리하고 상한을 제거합니다.
   12. 위의 세척 단계(1.2.10 및 1.2.11)를 두 번 반복합니다.
       참고 : 세 가지 세척 단계는 표면에 구슬의 접착을 줄이고 물방울의 자유로운 이동을 용이하게하기에 충분하다.
   13. 2.5 mg/mL의 농도로 실행 중인 버퍼의 비드를 다시 일시 중단합니다. 이 마이크로비드 솔루션은 EWOD 칩과 함께 사용할 준비가 되었습니다.
3. 뉴트라비딘 컨쥬게이트 고추냉이 과산화증(HRP) 및 이차 생체화 항체의 용액을 러닝 버퍼에서 각각 1 μg/mL에 대한 최종 농도로 준비한다(BG^검출6에사용).
   참고: 항원(표1)을표적으로 하기 위해 0.5~4.0 μg/mL에 이르는 이차 생체질화 항체의 다양한 농도를 성공적으로 시험하였다.
4. 분석법을 실행하기 직전에 루미놀과 과산화수소 용액의 동일한 부피를 혼합하십시오.
   참고: 루미놀은 항원(예를 들어, 병원체)을 표적으로 하는 이차 항체에 공유적으로 결합되는 HRP 효소에 기초한 결합 이벤트의 수를 정량화하는 데 사용된다. 그러나, 상이한 보고 분자 및 전략은 화학발광 및 루미놀 대신에^{검출(17)을} 위해 사용될 수 있다.

2. EWOD 칩 부품의 제조 및 표면 처리

참고: EWOD 칩은 액적의 뚜렷한 접촉 각을 번갈아 가며 액적의 높이를 정의하는 패턴 크롬 전극이 있는 작동 판으로 구성됩니다.

1. 표준 CAD 소프트웨어를 사용하여 전극과 커넥터의 설계를 2D로 그립니다. 사용된 용매를 저장하기 위해 5 x 5 mm^2의 치수를 가진 폐기물 수집 패드도포함한다(그림 1).
   참고 : 물방울을 조작하려면 각각 1.7 x 1.7 mm^2의치수를 가진 47 개의 전극을 사용합니다. 이 전극 크기는 1.5 μL에서 3 μL에 이르는 액적 부피를 수용합니다(500 μm 간격의 경우). 경험에서 500 μm 간격으로 작업할 때 1.5 μL은 작동할 수 있는 최소 액적 크기입니다. 그것은 사각형 패드에 외사되는 물방울 (투영) 윤곽에 대략 해당합니다. 그러나, 유체의 신체의 저항(마찰)에 의해 야기되는 것 이외에 는 어떠한 이론적 제한도 없다. 그럼에도 불구하고 500 μm 간격을 사용하여 신뢰할 수 있는 작동을 위해 부피가 3 μL을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 전극은 48채널 전자 장치로 처리됩니다.
   참고: 패드의 설계 치수와 크기는 프로토콜을 구성하는 의도된 부량 및 실험실 단위 운영(Luos)에 따라 달라질 수 있습니다.
2. 크롬 마스크를 유리 기판에 인쇄하기 위한 마스크 제조 서비스로 설계 도면을 보냅니다. 크롬 층의 두께는 100 nm입니다.
   참고: EWOD 칩의 기판으로 사용되는 포토마스크의 크롬 층은 정의상 불투명합니다. 각 전극의 설계에는 반투명도를 보장하기 위한 그리드 레이아웃이 포함되어 있습니다.
3. 정밀 CNC 다이싱 / 절단 톱으로 56 x 56mm^2의 크기로 플레이트를 잘라냅니다.
4. 두 코팅 단계에서 분리하기 위해 전기 접점 위에 마스킹 테이프를 붙입니다.
5. 6 μm Parylene-C를 표면에 증착하여 판 크롬 유리 판을 유전체 층으로 코팅합니다. 고함 공정^18은 파릴렌 증착시스템(재료 표)에서7.4 g의 DPX-C와 함께 사용된다.
6. 스핀코트 비정질 불소중합체(재료표)를플레이트 위에 30s에 대해 1500 rpm에서 스핀 코터를 사용하여 30분 동안 140°C에서 구워줍니다.
   주: 이렇게 하면 표면 소수성 렌더링됩니다. 하나는 표면에 물 방울을 배치하여 코팅이 성공적으로 증착되었는지 여부를 확인할 수 있습니다. 액적과 플레이트 사이의 접촉 각은 110º 의 영역에 있어야 합니다.
7. 전기 접점에서 마스킹 테이프를 제거합니다.
8. 스핀코트 비정질 불소 중합체(표)를 사용하여 1500 rpm에서 30s의 4인치 실리콘 웨이퍼 위에 30s의 스핀 코터를 사용하여 140°C에서 30분 동안 구워줍니다.
   참고 : 분석 기간 동안 이산 방울의 원활한 이동을 용이하게하기 위해 작동 및 커버 플레이트의 표면이 모두 소수성인 것이 중요합니다.

3. DMF 플랫폼에서 EWOD 칩의 로딩, 조립 및 작동

참고: EWOD 칩은 작동 플레이트와 전도성 접지 커버 플레이트 사이에 0.5mm의 간격을 정확하게 정의한 병렬 플레이트 구성을 사용하여 작동합니다. 이 샌드위치 어셈블리는 현재 섹션에 설명되어 있습니다.

1. DMF 플랫폼^6에서 뚜껑을 제거하고 벤치에 놓습니다.
   참고 : 어두운 패서데이 케이지 챔버는 검출 중에 미광 및 전자기 간섭을 방지하기 위해 필요합니다. 뚜껑에는 인터록이 없으므로 플랫폼을 통해 물방울의 움직임을 관찰 할 수 있습니다.
2. 깨끗한 작동 판을 회전 단계에 놓고 크롬을 위쪽을 향하게 합니다. 플레이트는 오목한 스테이지의 왼쪽 위 모서리와 정렬되어야합니다(그림 2A).
3. 47개의 접지 핀이 있는 패널을 사용하여 상단에서 작동 플레이트를 고정합니다. 이렇게 하면 플레이트가 제자리에 고정되고 접촉 핀과의 정렬이 용이합니다.
4. 0.5 mm 심과 2 mm 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 분리기를 회전 스테이지상에 놓고, 작동과 커버 플레이트 사이의 제어된 간격을 제공한다.
   참고: 선택적으로, 위킹 페이퍼는 다음 단계 전에 물방울을 알리인용하기 전에 폐기물 처리 패드에 놓을 수 있습니다. 분석이 진행됨에 따라 폐기물은 분석의 끝에서 제거 될 수있는 종이에 직접 흡수됩니다.
5. 액적을 제안된 로딩 패드에 로드합니다(그림1).
   1. Aliquot 4 개의 2.5-μL 방울을 실행 버퍼에서 B-, A-, R-, E-표시 패드, 각 패드에 1 방울.
   2. Aliquot 2.5 μL 의 루미놀:H_2O2 (1:1, v/v) 용액을 D-표시 패드에.
   3. Aliquot 2.5 μL의 노이트라비딘은 F-표시 패드 에 HRP (1 μg/mL)로 공액화하였다.
   4. Aliquot 2.5 μL의 바이오티니티질이차전항체(1 μg/mL)를 G-표시 패드상에.
   5. 공액 1 차 항체 (2.5 mg / mL)를 가진 마이크로 비드의 Aliquot 2.5 μL은 I-표시 패드에 이동합니다.
   6. 알 수 없는 샘플의 2.5 μL을 C-표시 패드 에 Aliquot.
      참고: 제안된 로딩 패턴은 실험 레이아웃의 한 예에 불과하지만, 이러한 변경 사항이 소프트웨어에 정의된 순서와 일치하는 한 로딩 패턴을 사용자의 요구에 맞게 변경할 수있습니다(보충 파일 1).
6. 커버 플레이트를 둥근 오목 영역 외에 리그 표면에 놓고 오목한 부분과 작동 판 의 상단에 측면으로 밀어 넣습니다(그림2B).
7. 영구 자석을 커버 플레이트 위에 놓고 두 개의 래치를 슬라이딩하여 고정합니다(그림2C).
8. 스테이지를 180° 회전하고 로드된 물방울이 여전히 제자리에 있는지 시각적으로 검사합니다(그림1C).
   참고 : 하나는 투명 한 단계와 액추에이션 플레이트의 뒷면을 통해 액적의 위치와 모양을 볼 수 있어야합니다(그림 2D). 로딩 전극 패드 위에 둥근 물방울이 보일 수 있다면 분석이 실행될 준비가 되었습니다. 경우, 물방울이 변위되면 자석과 커버 플레이트를 제거 한 다음 깨끗한 파이펫으로 변위 된 물방울을 회수하고 로딩 패드에 다시 놓습니다.
9. 각 액적의 로딩 위치가 소프트웨어의 프로그래밍된 작동 순서와 일치하는지 확인합니다(소프트웨어에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1 참조).
   참고: 물방울의 위치를 육안으로 확인할 수 있도록 광검출기를 분리해야합니다(그림 2D).
10. 스크리닝된 광검출기를 회전 단계의 슬롯에 "캔"으로 배치합니다.
    참고: 광검출 시스템은 광다이오드 주위를 회전하며, 넓은 수집 영역(10 x 10mm^2)을통해 추가 광학 없이 광 수집을 최대화하고 노이즈^6을최소화하기 위한 트랜스 임피던스 증폭기를 사용합니다. 그러나 시스템은 매우 민감하며 미세 신호를 수집할 수 있습니다. 소음 수준을 줄이기 위해 여러 가지 전자 기반 전략이 구현되었습니다(예: 광검출 시스템은 스크리닝된 "can"으로 알려진 금속 케이싱인 패데이 케이지에 배치하여 보호되었습니다).
11. 케이블을 "캔"으로 선별된 광검출기에 연결합니다.
    참고: EWOD 칩이 광검출기에 정렬되면 DMF 플랫폼이 완전히 조립되어 작동할 준비가 되었습니다.
12. DMF 플랫폼 위에 뚜껑을 놓고 허트포드셔 대학교에서 개발한 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 프로그램 순서를 시작합니다.
    참고: 추가 소프트웨어는 CSV 파일에서 시간 함수로 액적의 발광을 읽고 기록하는 데 사용됩니다(보조 파일 2참조).
    1. 프로그래밍된 시퀀스(보충 파일 1참조) 프롬프트 메시지가 인터페이스에 표시되어 운영자에게 "루미놀 방울이 추출된 자기 비드를 수집할 준비가 되었습니다" 또는 "검출 액적을 감지 사이트로 이동할 준비가 되었는지 확인합니다." 두 경우 모두 시퀀스를 진행하려면 연산자의 확인이 필요합니다.

4. 시각적 모드에서 작동 (프로토콜 최적화를위한 선택 사항)

참고: 원하는 경우 모든 액적 기반 작업을 시각화하기 위해 3.10-3.12 단계를 건너뛰고 다음 작업으로 대체하여 분석기를 조작할 수 있습니다.

1. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 프로그램 순서를 시작합니다.
   참고: 시각적 모드에서 작동하는 동안 액적 이동을 관찰할 수 있으며, 이는 프로토콜 최적화 중에 유용합니다. 첫째, 자기 분리 작업의 재현성을 점검한다. 예를 들어, 사용되는 비드의 양이 너무 낮으면 자기 분리가 발생하지 않으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이며, 구슬의 양이 너무 높으면, 액적은 비드 펠릿에 의해 고정될 수 있다. 둘째, 일부 액적 제형으로서 새로운 분석법의 신뢰성을 확인하기 위해 관찰에 의해 검출될 수 있는 작동 장애를 야기할 수 있다.
2. 메시지가 표시되면 회전 단계의 슬릿에 "캔"으로 선별된 광검출기를 장착합니다.
3. 소켓에 핀을 삽입하여 케이블을 "캔"으로 선별된 광검출기에 연결합니다.
4. DMF 플랫폼 위에 뚜껑을 놓고 분석작업을 다시 시작합니다.
   참고: CSV 파일에서 시간 함수로 물방울의 발광을 읽고 기록하기 위한 추가 소프트웨어를 사용하십시오(보조 파일 2참조).

5. 액체 폐기물을 제거하고 칩을 청소하십시오.

주의: 청소 전에 장비가 꺼져 있고 전원(컴퓨터, 주)에서 분리되어 있는지 확인합니다. 칩에서 생물학적 샘플을 제거 할 때 장갑, 실험실 코트 및 고글 보호 유리 (PPE)를 착용하십시오!

1. 작동 플레이트의 전극과 사용된 용매에 액세스하려면 DMF 플랫폼 뚜껑을 열고 스테이지를 180°로 회전시려면
2. 자석 케이스를 힌지 해제하고 회전 단계에서 자석을 제거하고 벤치에 놓습니다.
3. 핀셋 한 쌍으로 슬릿에서 커버 플레이트 실리콘 웨이퍼를 제거하고 DI 물로 헹구고 압축 공기로 건조시키고 웨이퍼를 저장하고 재사용할 수있는 페트리 접시에 놓습니다.
4. 마이크로파이펫을 사용하여 표면을 건드리지 않고 패드에서 액체 폐기물을 이동시면 됩니다.
5. 흡수성 종이(필터 재료)를 사용하여 액추에이션 플레이트에서 액체를 배출하여 표면을 청소합니다.
   참고 : 표면을 그대로 유지하면 여러 용도로 사용할 수있는 작동 판의 수명이 증가합니다.
6. 깨끗한 파이펫을 사용하여 깨끗한 DI 물방울로 전극 표면을 부드럽게 쓸어 서 작동 플레이트를 청소하십시오. 그런 다음 위킹 페이퍼 (필터 재료)로 물방울을 제거하십시오.
   주의: 생물학적 물질로 오염된 티슈, 종이, 파이펫 팁 및 장갑을 바이오 폐기물 쓰레기통에 폐기하십시오.
7. 다른 분석법에 대해 작동 플레이트를 사용하거나 DMF 플랫폼에서 제거하여 보관 또는 재활용하십시오.

결과

액추에이션 전압 충격은 분석법을 수행하기 위한 최적의 조건이 무엇인지 를 밝히기 위해 조사되었다. 버퍼의 물방울이 다양한 작동 전압에서 구동되고 그 움직임이 기록되었습니다. 조사결과(도 3)는근평균 제곱작동 전압(Vrms)과 평균 속도 사이의 상관관계가 존재하였다. 그러나 V_rms에 대한 높은 값을 사용할 때 작동 플레이트의 수명이 감소했습니다. 이러한 결과에 기초하여, 105V_rms가 표준 작동 전압으로 선택되었고, 120 V_{rms는 H2}O 2/루미놀 액적및 165V_rms 추출 LUO에 대해 가장 잘 작동하는 것으로 나타났다. 이러한 전압은 자동화된 프로그래밍 시퀀스에 포함되었다(보충파일 1).

2개의 면역분석(도4)은4개의 상이한 병원체에 대한 DMF 플랫폼과 함께 EWOD 칩을 사용하여 성공적으로 시험하였다(표1). EWOD 칩은 로딩 패드에서 혼합 영역으로 그리고 마지막으로 폐기물로 물방울의 연속적인 이동을 용이하게했습니다. ELISA를 완료하기 위해 프로토콜 전체에 걸쳐 반복되는 두 가지 기본 Luos가 있었습니다. 첫 번째는 추출 LUO; 여기서 간략하게 설명된 바와 같은, 부유된 비드를 함유하는 액적들은 혼합 영역의 중간에 분리 부위로 구동되었고, 자석은 칩에 접근하고 자석 비드를 펠릿으로 풀링하기 위해 자동으로 활성화되었다(도5). 다음으로, 물방울을 폐패드쪽으로 이동시키고, 구슬을 작동판 상에 남기고, 따라서 추출 LUO를 결론지었다. 혼합은 EWOD 칩에서 일어날 다음 키 LUO이었다. 병원균의 알 수없는 농도를 가진 골화 샘플을 전기 습윤에 의해 구슬로 이동하였다. 이어서 구슬을 혼합 영역(총 10패드)에 걸쳐 응집된 구슬로 옮기는 방식으로 재혼하였다. 이 두 루오스는 6 내지 10분 만에 병원균을 연속적으로 검출하여 소형화되고 신속하며 재현 가능한 시료 처리를 용이하게 하기 때문에 필수적이었다.

원하는 수준의 자동화를 충족하기 위해 프로토콜의 변형이 도입될 수 있습니다. 예를 들어, 비드는 항원 고갈액으로부터 분리되었고, 이어서 폐패드로 옮겨져, 기본적인 추출 LUO를 반복한다. 이 단계에서, 프로토콜은 검출 항체가 이미 HRP에 공액되었는지 여부에 따라 분기할 수 있으며, 상이한 항원검출을 위해 총 8개의 루오(Luos)를 효과적으로 사용할 수있다(도 7A-C). 이러한 경우, 검출 항체를 가진 물방울을 구슬을 가져온 다음 작동에 의해 혼합시켰다. 대안적으로, 검출 항체를 뇌트라비딘-HRP 컨쥬게이트에 결합하는 것은 EWOD 칩 상에서 순차적으로 수행될 수 있었고, 대장균의 정량화를 위해 입증된 바와같이(도 7D). 두 프로토콜, 8 단계 및 10 단계 ELISA(그림 4),항원의 재현 가능한 검출을 산출.

배양 시간 및 컨쥬게이트 농도는 실험적으로 분석에 대한 최적의 조건을 찾기 위해 다양하였다(도7A). 160s의 배양 시간과 2 μg/mL의 접합체 농도가 신호 강도의 36% 증가와 배경 잡음 수준에서 거의 변화가 없는 최고의 신호 대 잡음 비를 달성한 것으로 나타났습니다. 대표 결과 섹션에 사용된 모든 수치와 데이터는 이전 작업^6에서수정되었습니다.

1 차 / 체취 항체	검출 항체	Antigen
안티 휴먼 세럼 알부민 [15C7] (안티 HSA, Abcam ab10241)	말 무 페록시다아제 (HRP) 태그 안티 HSA [1A9] (Abcam ab24438)	휴먼 세럼 알부민 (HSA, 아캄)
Rb 안티 BG 폴리클로날	바이오티니얼 Rb 안티-BG 폴리클로날	B. 글로비기 (BG) 포자
Rb 안티 대장균 MRE 162 폴리클로날	바이오티니얼 Rb 항-E.Coli 162 MRE 폴리클로날	대장균 MRE 162
염소 안티 MS2 폴리 클로날	생체 별 RB 안티 MS2 폴리 클로날	MS2 박테리오파지 바이러스

표 1: 이 프로토콜로 시험된 항원 및 항체. 4가지 유형의 병원체 항원이 DMF 플랫폼을 사용하여 EWOD 칩의 기능을 입증하는 데 사용되었다.

그림 1: EWOD 플레이트의 설계. (a)전극(정사각형, 바닥)에 연결되는 커넥터(정사각형, 상단)가 있는 EWOD 작동 플레이트의 개략적 표기법. 각 패드에는 숫자가 할당되며 소프트웨어 코드(보충파일 1)에서주소를 지정할 수 있습니다. 로딩 전극 패드는 화살표로 표시되고 각 패드 위 또는 아래에 대문자로 표시됩니다. DMF 플랫폼의 주요 특징은 10개의 패드(31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47)로 구성된 믹싱 영역입니다. 시각적 가이드로 혼합 영역은 빨간색 사각형으로 표시됩니다. (b)패드의 마이크로 그리드 디자인의 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 디지털 미세 유체 시스템(DMF) 어셈블리의 구성 요소 및 주요 단계. (A) EWOD 작동 판을 고정하고 심을 회전 단계에 놓고 물방울을 적재하십시오. (B) 커버 플레이트를 놓습니다. (C) 자석 케이스를 장착하고 래치를 고정하고 스테이지를 180°로 돌십시오. (D) 자동 자석이 아래쪽을 가리킵니다. 액적의 위치와 모양을 검사하고 인쇄 회로 기판(PCB) 핀이 EWOD 칩의 접점으로 정렬되어 있는지 확인하고 광검출기를 연결하여 광검출기 슬롯에 넣습니다. 제어 전자 장치를 컴퓨터에 연결한 후 시스템은 분석기를 실행할 준비가 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 작동 플레이트의 반복적인 사용 및 작동 전압에 미치는 영향. 실행 버퍼에서 액적의 평균 속도는 작동 전압(파란색 원)과 3개의 독립적인 측정값(N = 3)의 표준 편차의 함수로 플롯됩니다. 여기서 플레이트당 분석의 수(회색 막대)는 더 높은 전압에서 표면의 향상된 붕괴를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: EWOD로 시험된 면역분석의 도면. 이 다이어그램의 각 원은 EWOD 칩에 로드된 2.5 μL의 부피를 나타냅니다. 제1 프로토콜(좌측)은 프리믹스 항체-HRP 컨쥬게이트를 사용하는 8개의 루오를 나타낸다; 동안, 두 번째 프로토콜은 10 개의 Luos를 포함하며, 별도로 생체 질화 검출 항체, 비드 추출 및 Neutravidin-HRP 컨쥬게이트의 연속 결합을 추가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 마그네틱 비드 추출. 이러한 과정은 (a-c) 매립된 자기 비드를 혼합 영역 의 중간에 자기 분리 부위로 작동시키는 (a-c) (패드 번호 33) (d, e) 자석이 비드를 중심으로 한 위치로 이동하며, (f, g, h) 방울이 폐패드1을 향해 작동되는 동안 자력에 의해 제자리에 고정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6: EWOD를 사용하여 완전한 면역 분석 서열, 시약, 시료 로딩 및 실험실 단위 작동을 보여주는. 각 행에는 액적의 특성 작업에서 샘플 이미지 시퀀스가 포함되어 있습니다. 작업은 열로 나뉩니다. 혼합은 검은 깨진 라인에 의해 제시 현탁액의 구슬에 대해 수행되지 않습니다. 물방울 방향은 파란색 화살표로 표시되고 구슬은 이미지 중 하나에서 주황색 화살표로 강조 표시됩니다. 회색 상자(오른쪽 아래 모서리)는 감지 영역의 움직임과 위치를 나타내는 두 이미지를 구분하며, 끊어진 선 원은 감지 영역을 강조 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: DMF 플랫폼을 통해 EWOD 칩에서 수행된 면역 분석에서 의 교정 곡선. 이전에 보고된 바와 같이^6에 대한 출력 전압(mV) 대 농도가 도시된 바와 같이: (A) 휴먼 혈청 알부민, 이는 컨쥬게이트 항체 농도 [C] 및 배양 시간, t_inc의효과를 연구하는데 사용되며, 공지된 분석물을 가진 비드의 혼합으로부터 측정된 LUO, (B) B. atrophaeus(BG) 포자는 면역분석의 재현성을 나타내는, (C) MS2 박테리오파지 면역분석, 및 (10프로토콜) 대장균. 약어 : 식민지 형성 단위 (cfu), 플라크 형성 단위 (pfu), 독립적 인 실험 (N), 실험실 단위 작동 (LUO)의 수. 이전 발행물 6에서 수정된^{그림입니다.} 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: Neutravidin-HRP를 컨쥬게이트로 사용하여 자동화된 ELISA 분석에 대한 DMF 플랫폼을 실행하는 완전한 시퀀스입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 화학 발광 측정을 위한 GUI 및 소프트웨어와 측정에서 예가 도시되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

EWOD 면역분석 프로토콜은 유연하고 분석 프로토콜에 의해 정의된 시약 유형, 안정성 및 사용 요건에 따라 다양한 실험실 단위 작업(예를 들어, 포획 항원, 혼합, 인큐베이션, 비드 추출, 세척)을 포함할 수 있다. 원리의 증거로서, 본 문서에서, 2개의 면역분석 프로토콜은 EWOD 칩을 기재한 8개 또는 10개의 LuOs(도4)의구현을 보여주는 것으로 고려된다. 이러한 소형화는 시약의 소비, 작동당 소요 시간, 본질적으로 총 실험 시간(6 내지 10분)을 모두 감소시킴으로써 ELISA의 효능을 증가시키는 마이크로리터, 이산 부피의 시약/어널리티로부터의 장점이 있다. 더욱이, 이 분석실험은 변이를 감소시키고^{면역분석기(17)의}정밀도를 향상시키는 액적의 시간적 조작으로 자동화된다. 현재 의 형식에서, 실험은 다음 섹션에서 추가 토론을위한 포인트입니다 각 분석의 시작 부분에 물방울의 수동 처리를 포함한다.

현재 DMF 방법의 한 가지 중요한 단계는 EWOD 칩의 표면에 액적을 분배하는 것입니다. 일반적으로 일회용 팁이 있는 마이크로파이펫을 사용하여 정확한 부피를 측정하고 로드합니다. 그러나, 일회용 팁의 액적과 충전된 표면 사이의 상호 작용 때문에 액추에이션 플레이트의 소수성 표면에 액적을 고정시키는 것이 어려워질 수 있다. 그 결과, 판에 남아 있는 대신 팁의 외부 표면을 따라 액적을 발사할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 마이크로 파이펫은 칩 표면에 수직으로 유지되어야하며, 그것을 건드리지 않고, 물방울을 표면과 접촉시켜 로딩 패드에 분배 할 수 있습니다. 물방울이 파이펫 팁에 달라붙는 경우, 스톡 솔루션으로 되돌리고 팁을 교환하고 신선한 물방울을 다시 입금하십시오. 현재 개념 증명 시스템의 추가 개발에서 액적의 자동 전달을 상상할 수 있습니다.

또 다른 중요한 단계는, 분석판을 실행하기 전에, 병렬 플레이트 어셈블리의 뚜껑을 닫는 것입니다. 프로토콜의 앞에서 설명했듯이, 뚜껑은 작동 판 위에 미끄러져야 합니다. 뚜껑의 소수성 표면은 작동 판에 앉아있는 물방울의 왜곡 및 변위를 방지합니다. 액적의 원활한 움직임을 보장하기 위해 깨끗한 작동 플레이트, 액적 및 칩 어셈블리의 올바른 하중을 사용하는 것이 좋습니다. 작동 판의 재사용이 가능합니다. 그러나 사이클 의 수는 작동 전압(그림 3)과표면상에 대한 세포체 / 시약 증착, 일명 바이오 파울링에 따라 달라집니다. 제시된 플랫폼은 크롬 인쇄 EWOD 칩을 사용하여 각 실험 후 120V의 작동 전압과 중간 플레이트 세척시 최대 4회 연속 측정에 안정적으로 재사용할 수 있습니다. 플레이트는 실험당 비용을 절감하기 위해, 오염제거(철저히 헹구기 전에 희석되지 않은 세정제로 표면을 브러싱)하여 비오오파울무질 불소 중합체(Tableof Materials)코팅 및 스핀 코팅을 플레이트 위에 재코팅하였다. 그러나, 작동 판 재활용은 수동 처리, 비용이 많이 드는 시약 (비정질 불소 중합체(재료의 표))및 특수 장비 (스핀 코터)가 필요합니다. 대체 EWOD 칩은 종이^19,아세테이트 필름 또는 인쇄 회로 기판(PCB)^20,21과같은 비용 효율적인 기판으로 성공적으로 조사됩니다. 이러한 일회용 소모품은 DMF 플랫폼의 안정적이고 저렴한 사용을 용이하게 할 수 있으며 생체 오염 문제를 피할 수있는 수단을 제공 할 수 있습니다.

바이오폴링은 생물학적 응용에 대한 EWOD의 주요 한계입니다^22,23. DMF에 대한 이전 연구는 생체 오염에 기여하는 두 가지 메커니즘, 즉 소수성 상호 작용으로 인한 수동 흡착, 전기장이 적용될 때 나타나는 정전기 구동 흡착^24를확인했습니다. 현재 문서의 결과는 높은 작동 전압에서 작동 판 재사용성이 감소하는 것을 문서화했기 때문에 이 이론과 일치합니다. 한 가지 가능한 설명은 단백질이 불소 중합체 코팅(Teflon-like) 표면에 쉽게 흡착하고 자연 그대로의^{표면(24)에}비해 오염시 더 빨리 응집된다는 것입니다. 그 결과, DMF에 단백질 관련 공아는 정량화하기 어렵고, 해매, 교차 오염 및 감소된 정밀도^17의손실을 경험할 수 있습니다. 최악의 시나리오는 중요한 양의 단백질 이염으로 장치를 쓸모 없게 만드는 경우입니다. 생체오염을 최소화하기 위해, 칩 상에서 액적의 체류 시간을 최소화하는 것에서부터,^{코팅(23)을}통해, 첨가제(즉, 계면활성제 또는 플루론산)를 생체물질-함유 액적^내로의한 다양한 접근법이 조사되었다. 따라서 EWOD에 대한 면역 분석 분석의 중요한 측면은 손에 특정 프로토콜과 호환되는 항 생체 오염 전략을 선택하는 것입니다.

자동화된 DMF 플랫폼은 시약과 매말량 모두에 마이크로리터 부피를 사용하는 동안 실행당 단일 샌드위치 ELISA 테스트를 수행하도록 설계되었습니다. 필요한 경우, 기존의 샌드위치 ELISA 키트는 보조 실험실 장비와 함께 실행 당 더 높은 처리량을 초래 사전 코팅 된 96 웰 또는 384 웰 플레이트에 따라 존재; 시약 가격에만 따라 분석/우물당 대략적인 비용은 각각 6.04 USD(580 USD/96) 및 0.33 USD(2×580 USD/384)입니다. 이는 중앙 집중식 실험실 시설에서 숙련된 기술 인력에 의해 일반적으로 처리되는 많은 수의 샘플에 이상적인 기존의 ELISA 방법을 렌더링합니다. 그러나, 원격 위치에서, 환경 모니터링을 위한 ELISA의 상세한 비용 분석은 자본 비용 (즉, 실험실 운영 비용, 재발 비용, 견본 수송, 소모품 및 인력)이 ELISA 당 실제 가격이 60 USD였으며 그 중 34 USD는 샘플²⁵당 공급에 대한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 제안된 DMF 플랫폼은 이식가능하고, 작동을 위한 최소한의 훈련이 필요하며, 사전 코팅된 비드와 함께 몇 분 안에 샘플-투-답변 분석을 제공할 수 있다. 따라서 제시된 기술은 필요한 지점에 배치하고 중앙 집중식 실험실에서 사용할 수 있는 분석을 보완할 수 있습니다.

대표적인 결과 섹션에서, 자동화된 DMF 면역분석 플랫폼은 방위 적용을 위한 병원균의 직접 검출에 사용되었다. DMF 플랫폼을 위한 다른 가능한 애플리케이션은 생체 진단, 지속적인 모니터링 및 자동화된 샘플링을 포함하지만 이에 국한되지 않습니다. 잠재적으로 DMF는 개인화된 헬스케어를 위한 요점 관리에서, 뿐만 아니라 공중 병원 취득한 감염에서 환자의 보호를 위한 통제된 환경 감시, 농업을 위한 작물 감시 시스템에 각종 분야에 영향을 미칠 수 있었습니다 식품 생산.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.