АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Гематоэнцефалический барьер (BBB) является многоклеточным нервно-сосудистым подразделением, плотно регулирующим гомеостаз мозга. Объединив iPSCs человека и технологии органа на чипе, мы создали персонализированный чип BBB, пригодный для моделирования заболеваний и прогнозов проницаемости лекарств CnS. Подробный протокол описан для генерации и эксплуатации чипа BBB.

Аннотация

Гематоэнцефалический барьер (BBB) формируется нервно-сосудистыми подразделениями (НВУ), которые защищают центральную нервную систему (ЦНС) от целого ряда факторов, обнаруженных в крови, которые могут нарушить тонкую функцию мозга. Таким образом, BBB является основным препятствием для доставки терапевтических препаратов для ЦНС. Накопленные данные свидетельствуют о том, что BBB играет ключевую роль в начале и прогрессировании неврологических заболеваний. Таким образом, существует огромная потребность в модели BBB, которая может предсказать проникновение cnS-целевых препаратов, а также прояснить роль BBB в области здравоохранения и болезней.

Недавно мы объединили технологии органов на чипе и индуцированных стволовых клеток (iPSC) для создания чипа BBB, полностью персонализированного для человека. Эта новая платформа отображает клеточные, молекулярные и физиологические свойства, которые подходят для прогнозирования транспортировки лекарств и молекул через человека BBB. Кроме того, используя специфические для пациента чипы BBB, мы создали модели неврологических заболеваний и продемонстрировали потенциал для персонализированного применения прогностической медицины. Приведенный здесь подробный протокол, демонстрирующий, как генерировать микросхемы BBB, полученные из iPSC, начиная с дифференциации микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, полученных iPSC (iBMECs) и в результате смешанных нейронных культур, содержащих нейронных прародителей, дифференцированных нейронов и астроцитов. Также описана процедура посева клеток в органный чип и культивирование чипов BBB под контролируемым ламинарным потоком. Наконец, приводятся подробные описания анализа чипов BBB, включая параклеточные анализы проницаемости для оценки проницаемости препарата и молекулы, а также иммуноцитохимические методы для определения состава типов клеток в чипе.

Введение

BBB является очень селективным барьером, который отделяет ЦНС от циркулирующей крови. Он защищает критические функции мозга от потенциально разрушительных веществ, факторов и ксенобиотики, а также позволяет приток питательных веществ и других метаболитов, необходимых для поддержания гомеостаза мозга1. BBB является многоклеточным NVU, в котором перициты, астроциты endfeet, и нейронные процессы непосредственно контакт мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (BMECs). Эти взаимодействия позволяют BMECs формировать специализированные барьерные свойства, которые поддерживаются плотными и придерживает соединения2,3. Формирование этого барьера ограничивает параклеточный проход молекул, но содержит поляризованные транспортеры для активного переноса молекул в ЦНС или обратно в кровь1. Из-за этих уникальных барьерных свойств, BBB представляет собой серьезное препятствие для доставки биофармацевтических препаратов в мозг, и, по оценкам, менее 5% FDA утвержденных малых молекул может достичь ЦНС4.

Модели животных широко используются для изучения пенетранса BBB и молекулярных механизмов, участвующих в разработке BBB5. В то время как модели животных точно представляют собой сложную многоклеточную среду in vivo, различия в экспрессии и активности перевозчиков BBB, а также субстрата специфики между видами часто исключают точную экстраполяцию данных о животных на людей6. Таким образом, модели на основе человека имеют решающее значение для изучения БББ человека и для использования в разработке препаратов, предназначенных для целевой ЦНС. Эта необходимость становится еще более очевидной в связи с растущим доминированием биологических, специфических для человека препаратов в области фармацевтического развития. Накопление доказательств свидетельствует о том, что скомпрометированный BBB связан с рядом тяжелых заболеваний ЦНС, включая опухоли головного мозга и неврологические заболевания7,8,9. Человеческие модели, верой он ко мне, отражающие эти заболевания, могут идентифицировать как 1) определить новые пути, которые могут быть направлены на разработку лекарств, и 2) предсказывают пенетранс ЦНС, тем самым сокращая время и ресурсы в доклинических исследованиях и, возможно, уменьшая частоту отказов в клинических испытаниях.

Модели In vitro были широко реализованы для изучения взаимодействия между BMECs и другими клетками НВУ и проведения экранов для перспективных BBB-проницаемых препаратов10. Чтобы воссоздать ключевые аспекты человеческого BBB, модели in vitro должны отображать физиологически значимые свойства (т.е. низкую парацеллюлярную проницаемость и физиологически релевантную трансэндотелиальную электрическую устойчивость (TEER) через эндотелиальный монослой). Кроме того, молекулярный профиль системы in vitro должен включать экспрессию репрезентативных функциональных транспортных систем. Как правило, модели in vitro состоят из эндотелиальных клеток, которые совместно культивируются на полупроницаемой мембране с комбинациями других клеток НВУ для повышения свойств BBB11. Такой подход позволяет просто и относительно быстро оценить барьерную функциональность и проницаемость молекул. Такие модели BBB на основе клеток на основе клеток могут быть установлены с помощью животных или человеческих клеточных источников, включая клетки, изолированные от хирургических иссечений или увековеченные линии BMEC.

Недавно, протоколы для дифференцировать человека плюрипотентных клеток в BMECs были введены в качестве привлекательного источника для in vitro человека BBB модели12,13. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) полученные BMECs (iBMECs) являются высоко масштабируемыми, демонстрируют критические морфологические и функциональные характеристики человека BBB, и нести генетику пациента. В культуре iBMECs образуют монослой, который выражает плотные маркеры соединения и отображает в виво-подобных плотных комплексах соединения. Эти клетки также выражают маркеры BBB, в том числе транспортер глюкозы BBB, транспортер глюкозы 1 (GLUT1). Важно, и в отличие от других альтернативных источников клеток для человека BMECs, iBMECs приобрести барьерные свойства со значениями выше, чем те, измеряется в vivo14, поляризуйте вдоль базолатеральной оси, и выразить функциональные насосы efflux. Кроме того, использование iPSCs от различных предметов, как 1) приветствует возможность проверить аспекты BBB в персонализированной медицинской основе и 2) обеспечивает гибкий источник для генерации дополнительных типов клеток НВУ. Создание этих клеток из изогенного источника клеток для создания персонализированных чипов BBB также поможет в понимании межиндивидуальных различий в ответных мерах на наркотики, что является основной причиной устойчивости или скомпрометированной реакции на лечение, наблюдаемое в клинических исследованиях.

Использование iBMECs в качестве монослойных в блюде или на полупроницаемой вставке transwell представляет собой мощный подход для моделирования BBB. Эти системы, как правило, являются надежными, воспроизводимыми и рентабельными. Кроме того, функциональные анализы, такие как TEER и проницаемость относительно просты в выполнении. Тем не менее, двумерные (2D) системы не в состоянии резюмировать 3D характер ткани in vivo, и они не имеют физиологических сил сдвига стресса, предоставляемых циркулирующих крови и клеток крови. Это ограничивает способность сосудистого эндотелия в этих моделях развивать и поддерживать внутренние свойства и функции BBB.

Микроинженерные системы, выложенные живыми клетками, были внедрены для моделирования различных функциональных возможностей органов в концепции, называемой органом на чипах. Воссоздавая виво-подобную многоклеточную архитектуру, интерфейсы тканей и тканей, физико-химическую микросреду и сосудистую перфузию, эти микроинженерные платформы генерируют уровни ткани и функциональности органов, которые невозможны с обычные 2D системы культуры. Они также позволяют высокое разрешение, в режиме реального времени изображения, а также анализ биохимических, генетических и метаболических профилей похож на живые клетки в ткани in vivo и органа контексте. Тем не менее, особая проблема органа на чипе заключается в том, что проектирование, изготовление и применение этих микроинженерных чипов требует специализированных инженерных знаний, которые, как правило, не хватает в биологически ориентированных научных лабораторий.

Недавно мы объединили технологии iPSC и орган-на-чипе для создания персонализированной модели чипов BBB15,16. Для преодоления описанных технологических проблем коммерчески доступный Chip-S1 используется вместе с модулем культуры, инструментом, предназначенным для автоматизации обслуживания чипов простым и надежным способом (Emulate Inc.). Чип BBB воссоздает взаимодействия между нервными и эндотелиальными клетками и достигает физиологически значимых значений TEER, которые измеряются пользовательскими чипами органов с интегрированными золотыми электродами17. Кроме того, чип BBB отображает низкую параклеетальную проницаемость, реагирует на воспалительные сигналы на уровне органов, выражает активные насосы efflux и демонстрирует прогностический перенос растворимых биомаркеров и биофармацевтических препаратов. Примечательно, что чипы BBB, генерируемые из нескольких особей, фиксируют ожидаемые функциональные различия между здоровыми людьми и пациентами с неврологическими заболеваниями15.

В описанном ниже протоколе описывается надежный, эффективный и воспроизводимый метод генерации чипов BBB на основе iPSC в условиях динамического потока. Руководство предоставляется по типу анализов и анализа конечных точек, которые могут быть выполнены непосредственно в чипе BBB или из отбора сточных вод. Таким образом, протокол демонстрирует спектр методов, которые могут быть применены для оценки биологических и функциональных свойств и реакций в модели, соответствующей человеку.

Краткое описание чипа BBB на основе iPSC приведено здесь. IPSCs человека первоначально дифференцированы и распространяются в флягах культуры ткани как свободно плавающие агрегаты нейронных прародителей, называемых эквалайзер-сферы. Верхний канал Chip-S116,18,19 посеян с разрозненные эквалайзер-сферы, которые образуют "мозговой стороне" чипа, как клетки дифференцировать в течение 7 дней в смешанной культуре нейронных клеток-прародителей (iNPCs), iAstrocytes, и iNeurons. IPSCs человека также дифференцированы в плитах культуры ткани в iBMECs. Нижний канал чипа посеян с iBMECs для формирования "кровь стороны", как они развиваются, чтобы сформировать эндотелиальную трубку (Рисунок 1). Пористая внеклеточная матрица (ECM) с покрытием мембрана, которая отделяет верхний и нижний каналы 1) позволяет образованию клеток к клетке взаимодействия между каналами и 2) позволяет пользователю запускать проницаемость анализов и изображений клеток в любом канале с помощью обычного светового микроскопа.

протокол

1. Поколение клеток нейро-прародителя, полученных iPSC(iNPCs)

  1. Продукция эквалайзера из колоний iPSC, как описано ниже и как ранее опубликовано20,21,22.
    1. Культура iPSC колоний для слияния на подвале мембраны матрицы покрытием 6 хорошо пластин (0,5 мг/ пластины) в mTESR1 или других коммерческих средств массовой информации (см. Таблица материалов).
    2. Удалить iPSC среды и заменить 2 мл эквалайзера среднего ЗСМ; DMEM:F12 7:3 дополнен 100 нг/мл базового фактора роста фибробластов (bFGF), 100 нг/мл эпидермального фактора роста, 5 мкг/мл гепарина и 2% B27 дополнения.
    3. Очистите дно каждого слияния хорошо с задней стерильной 1000 л пипетки отзыв или клеточной скребок.
    4. Соберите все клетки и поместите в ультра-низкое вложение T25 колбу, чтобы спонтанное образование свободно плавающих сфер. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
    5. Кормите сферы каждые 2-3 дня, когда среда желтеет, заменяя половину среды свежим ESM. Это позволяет сферам оставаться в условиях среды, что очень важно для их роста и поддержания.
      1. Наклоните колбу на трубчатую стойку и дайте сферам осесть под действием силы тяжести в течение 1-2 мин до угла колбы.
      2. После заселения, аспирированные половины супернатанта с 5 мл или 10 мл серологический пипетка и заменить свежим, предварительно подогретый ESM.
    6. Прохождение эквалайзера-сферы еженедельно путем измельчения сфер до 200 мкм диаметром, как ранее описано23,20,21. Эквалайзер может поддерживаться до 25 проходов и идеально подходит при использовании между проходами 8-25.
  2. Подготовка одноклеточной подвески iNPCs:
    1. Чтобы вызвать нервную дифференциацию, разъедините эквалайзер на одиночные клетки.
    2. Соберите сферы 3-4 дней после измельчения из колбы T75 и перенесите в коническую 15 мл, затем дайте ей постоять 2 мин или пока все сферы не будут урегулированы внизу.
    3. Медленно удалите ESM с помощью пипетки 5 мл, не нарушая оседлые сферы. Добавьте 1 мл диссоциационизмовательного раствора (см. Таблицу Материалов)и инкубацию в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
    4. Вихрь диссоциации решения и сферы после 5 мин инкубации, чтобы обеспечить, чтобы любые оседлые сферы рассматриваются.
    5. Медленно удалите решение диссоциации. Добавить 1 мл нейронной дифференциации среды NDM; DMEM: F12 с 2% B27 минус витамин А, 1% N2 дополнения, и человеческий мозг полученных нейротрофический фактор (hBDNF, 20 нг /мл)».
    6. Тритурируйте сферы на одиночные ячейки, прокладывая пипетку 1 мл, а затем 200 пипетки, пока все сферы не разъединяются. Избегайте образования пузырьков во время процедуры трихатурации.
    7. Подсчитайте диссоциированные клетки с помощью гемоситометра и разбавьте клетки до конечной плотности 1 х 106 клеток/мл. Можно изменить плотность в зависимости от приложения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая плотность (до 6 х 106 клеток/мл) рекомендуется для краткосрочных культур до 3 дней, а более низкая плотность рекомендуется для долгосрочного применения до 3 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки теперь готовы к семени в верхнем канале чипа, чтобы сформировать "сторону мозга".

2. Дифференциация iPSCs на iBMECs

  1. Прохождение iPSCs от одного слияния хорошо 6 хорошо пластины в 1:6 соотношение в 6 хорошо подвале мембраны матричной пластины с покрытием. Пусть клетки придерживаются 24 h. Изменение iPSC среды ежедневно.
  2. Рассчитывайте клетки ежедневно с помощью гемоцитометра.
  3. Когда клетки достигают плотности 1,5-3,0 х 105 клеток/хорошо, замените iPSC среду с 3 мл некондициированной среды без bFGF »DMEM:F12 1:1, с 10% заменой сыворотки (KOSR), 1% несущественных аминокислот (NEAA), 0,5% глюкотаминовой добавки (Таблица материалови 100. Заменить средний ежедневно в течение 6 дней24.
  4. На 6-й день замените среду эндотелиальной клеткой (EC) средней (человеческой эндотелиальной сыворотки свободной среды (hESFM) дополненной 1% тромбоцитов-плохой плазменной сыворотки крупного рогатого скота, 20 нг/мл bFGF и 10 мкм все-транс ретинойной кислоты (RA)». Оставьте среду на 2 дня.
  5. Удалить EC среды и добавить 1 мл диссоциации раствора в скважине. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 35 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это считается длительным инкубационным временем в растворе диссоциации, используемом здесь, iBMECs может выдержать это лечение с жизнеспособностью клеток выше 90%.
  6. Отсоедините клетки от колодца, аккуратно протяните клеточную подвеску и собрав все клетки в коническую трубку 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте резких пипеток. Если клетки не отсоединяются легко, инкубировать в течение дополнительных 5 мин.
  7. Добавьте 1 том EC-среды в коническую 15 мл, чтобы инактивировать Accutase, центрифугу при 200 х г в течение 5 мин, удалить среду и заменить 1 мл EC среды (без bFGF и RA).
  8. Подсчитайте клетки с помощью гемоситометра и регулируйте плотность клеток до 14-20 х 106 клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки теперь готовы быть посеяны в нижний канал чипа, чтобы сформировать "кровь стороны".

3. Микрофабрикация чипа органа

  1. Используйте чип органа для модели чипа BBB и его производства, как это было сделано ранее16,18,19. Высокий чип органов канала (см. Таблица материалов) изготовлен из высокогибкой полидиметилсилоксана (PDMS) эластомер, который содержит два наложенных и параллельных микро-шкалы каналов, разделенных гибкой пористой мембраной. Размеры верхнего и нижнего микроканалов 1 мм х 1 мм и 1,0 мм х 0,2 мм соответственно. Эти два канала разделены 50 мкм толщиной PDMS-сделанных гибкой пористой мембраной мембра, содержащей поры диаметром 7 мкм с интервалом 40 мкм. Площадь поверхности пористой мембраны, отделяет каналы, составляет 0,171 см2.

4. Подготовка чипа

  1. Органные чипы поставляются расфасованные внутри носителя чипов, устраняя необходимость нарушить или исказить выравнивание чипа во время обработки. Кроме того, носитель чипа надежно подключается к портативному модулю ("Pod"), который выступает в качестве интерфейса между модулем культуры и чипом.
    1. Спрей упаковки чипов с 70% этанола и принести в кабинет биобезопасности (BSC).
    2. Откройте упаковку и выложить орган чип в стерильной чашке Петри. Ручка чип перевозчика только по бокам, чтобы избежать прямого контакта с чипом.
    3. Убедитесь, что вкладка перевозчика обращена вправо(рисунок 2),и при использовании нескольких фишек, выровнять их все в той же ориентации.
    4. Наметьте каждый чип на вкладке носителя (полная подготовка чипа и рабочий процесс показан на рисунке 3).

5. Активация поверхности и покрытие ECM

  1. Подготовка решения для активации поверхности
    1. Эмулировать реагент 1 (ER-1), при условии, во флаконе, содержащем 5 мг, является светочувствительным. Приготовьте свежий раствор ER-1 непосредственно перед использованием. Целостность ER-1 имеет решающее значение для успешной подготовки чипов.
    2. Выключите свет в BSC при обработке ER-1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ER-1 является раздражающим глаз и должны быть обработаны в BSC с надлежащей перчатки и защиты глаз.
    3. Разрешить РЕагенты ER-1 и ER-2 уравновесить до комнатной температуры (RT) перед использованием.
    4. Защитите раствор от света, обернув пустую стерильную 15 мл конической трубки фольгой.
    5. В BSC, кратко нажмите на ФЛАкон ER-1, чтобы урегулировать порошок в нижней части.
    6. Добавьте 1 мл буфера ER-2 в флакон и немедленно перенесите его содержимое на дно 15 мл, обернутой конической трубкой. Не пипетка смешивать. Цвет раствора, переносимого в коническую трубку, будет красным.
    7. Повторите шаг 5.1.6 3x. На последнем раунде, крышка ER-1 флакон и инверт, чтобы собрать любой оставшийся порошок из крышки, а затем передать раствор конической трубки; это доведет общий объем до 4 мл раствора ER-1.
    8. Добавьте 6 мл раствора ER-2 в раствор ER-1 4 мл в конической трубке 15 мл до конечной концентрации 0,5 мг/мл. ER-1 должен быть полностью растворен в рамках решения ER-2.
  2. Активация поверхности
    1. Используя пипетку P200 и стерильную наконечник фильтрованного пипетки 200 л, возьмите 200 л смеси ER-1.
    2. Поместите пипетку в нижнюю впускную часть и нажмите 20 Зл смеси ER-1 через нижний канал, пока смесь не начнет вытекать из нижней розетки канала.
    3. Добавьте примерно 50 кЛ смеси ER-1 и поместите ее в верхний канал входе. Нажмите смесь через верхний канал, пока он не начинает вытекать из верхней розетки канала.
    4. Удалите все излишки смеси ER-1 с поверхности чипа нежным устремлением. Убедитесь, что смесь ER-1 удаляется только с поверхности чипа, а не с каналов.
    5. Убедитесь, что каналы свободны от пузырьков воздуха перед ультрафиолетовой (УФ) активацией. При обнаружении пузырьков воздуха удалите пузырьки, промывая канал смесью ER-1.
    6. Поместите открытое блюдо, содержащее чипсы, в ультрафиолетовую коробку (предоставленную Emulate Inc.).
    7. Установите переключатель в задней части окна ультрафиолетового света на настройку "Consistent". Включите питание и инициируйте активацию УФ-излучения. Оставьте фишки под ультрафиолетовым светом на 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздействия УЛЬТРАФиосветного света на персонал.
    8. Удалите смесь ER-1 с обоих каналов.
    9. Вымойте каждый канал с 200 зл и раствором ER-2.
    10. Удалите ER-2 с обоих каналов.
    11. Вымойте каждый канал с 200 л стерильной холодной Dulbecco в фосфат-буферный солей (DPBS).
    12. Оставьте холодный DPBS внутри каналов до тех пор, пока не перейдите к следующему шагу.
  3. Внеклеточная матрица (ECM) подготовка и покрытие
    1. Подготовьте решение ECM, объединив отдельные компоненты ECM с холодным DPBS, водой или другим растворителем в конечных рабочих концентрациях. Решение ECM должно быть подготовлено свежим каждый раз, когда оно используется.
    2. Пальто как верхний и нижний каналы чипа с ECM, с составом, как определяется тип ячейки, которые будут посеяны. Смесь ECM должна поддерживаться на льду до использования.
    3. Используйте ламинин (50 мкг/мл) для покрытия "мозговой стороны", и коллаген IV и фибронектин смешивается в соотношении 4:1 (320:80 мкг/мл), чтобы покрыть "кровь стороны", как описано в разделе 5.6.
  4. Подготовка eCM aliquots
    1. Разбавить 1 мг/мл ламинина в холодном DPBS до конечной концентрации 50 мкг/мл. Aliquot и хранить при -20 градусах до использования.
    2. Растворите коллаген IV в 0,1% уксусной кислоты до концентрации 1 мг/мл. Инкубировать раствор при 2-8 градусов на ночь или на RT в течение 1-3 ч или до полного растворения.
    3. Приготовьте смесь коллагена IV:fibronectin 1 мл (320 л коллагена IV, 80 л фибронектина, 600 л стерильных двойных дистиллированных H2O). Смесь может храниться при -20 градусах Цельсия.
  5. Покрытие чипов eCM
    1. Полностью аспирируйте холодный DPBS с обоих каналов. Установите пипетку P200, чтобы занять 100 л коллагена IV: фибронектин раствор.
    2. Введите раствор через нижний канал входе до тех пор, пока небольшая капля формы на розетке. Оставьте небольшую капельку на входе после удаления кончика пипетки.
    3. Введите раствор ламинина через верхний канал входе до тех пор, пока небольшая капля формы на розетке. Оставьте небольшую капельку на входе после удаления кончика пипетки.
    4. Посмотрите внимательно на каналы, чтобы убедиться, что никаких пузырьков нет. Если пузырьки присутствуют, промойте канал соответствующим решением ECM до тех пор, пока все пузырьки не будут удалены.
    5. Повторите шаги 5.5.1-5.5.4 для каждого чипа.
    6. Добавьте 1,5 мл DPBS к крышке конической трубки 15 мл. Поместите крышку DPBS в 150-мм культурные блюда с чипсами, чтобы обеспечить дополнительную влажность и запечатать блюдо с parafilm. Для достижения наилучших результатов, инкубировать чипсы на 4 градуса Цельсия в одночасье.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании, клетки могут быть посеяны в тот же день, как активация чипа и ECM покрытие, хотя ночь инкубации является предпочтительным. Чипсы могут быть готовы к посеву 4 ч после добавления ECM и инкубации чипов на 37 градусов по Цельсию.

6. Посев канала «стороны мозга» и дифференциирование сфер эквалайзера на смешанные нейронные культуры

  1. Принесите блюдо, содержащее приготовленные чипсы, в BSC. Аккуратно промыть оба канала с 200 ЗЛ NDM.
  2. Избегая контакта с портами, тщательно аспирируйте излишки капель мультимедиа с поверхности чипа. Аккуратно агитировать подвеску клетки перед засеиванием каждого чипа, чтобы обеспечить однородную суспензию клеток
  3. Посев iNPCs в верхнем канале для создания "мозговой стороны"
    1. Семя клетки (1 х 106 ячеек/мл) в верхнем канале чипа. Добавьте наконечник P200, содержащий 30-100 л клеток, суспензию в верхний канал и аккуратно отпустите кончик из пипетки. Возьмите пустую пипетку P200, угнетайте поршень, вставьте в верхний канал розетки и осторожно потяните подвеску одиночных ячеек через чип.
    2. Обложка блюдо и передачи в микроскоп, чтобы проверить плотность посева и однородное распределение клеток в верхнем канале. Аккуратно удалите наконечник пипетки из входящих и выходных портов.
    3. Плотность посевов должна выглядеть как 20% покрытия. Если плотность посева выше или ниже, чем ожидалось, или неравномерно, верните фишки в BSC, промойте канал 2x с 200 л свежей среды, и повторите шаг 6.3.1.
    4. После подтверждения правильной плотности клеток, немедленно поместите чипы в инкубатор на 2 ч при 37 градусах Цельсия после посева каждой партии чипсов. Смойте клетки, которые не прикрепляются со свежим NDM.
    5. Держите клетки в статических условиях при 37 градусах Цельсия с ежедневной заменой NDM, по крайней мере 48 ч, прежде чем инициируя поток. iBMECs могут быть посеяны после присоединения iNPCs или на следующий день после посева iNPC.

7. Посев iBMECs в нижний канал для создания "кровь стороны"

  1. Принесите блюдо, содержащее приготовленные чипсы, в BSC. Аккуратно промыть нижнюю канал с 200 Зл еС среды.
  2. Избегая контакта с портами, тщательно аспирируйте капли избытка EC-среды с поверхности чипа, убедившись, что оставьте среду в обоих каналах. Аккуратно агитировать подвеску клетки перед посевом каждого чипа, чтобы обеспечить однородную суспензию клеток.
  3. Используя пипетку P200, составить 30-100 л суспензии iBMEC (14-20 х 106 ячеек/мл) и поместите наконечник в нижний канал. Аккуратно отключите наконечник от пипетки, оставив клеточный наконечник в порту входе.
  4. Угнетаете поршень на пипетке P200 с пустым наконечником, вставьте в нижнюю розетку канала и осторожно потяните одноклеточную подвеску через нижний канал, медленно выпуская пипетку.
  5. Аспирируй избыток клеточной подвески с поверхности чипа. Избегайте прямого контакта с впускными и розетками портов, чтобы гарантировать, что ни одна подвеска ячейки не аспирируется из каналов.
  6. Обложка чипа и передать его в микроскоп, чтобы наблюдать плотность посева. Нижний канал должен быть заполнен без наблюдаемых зазоров между клетками при наблюдении в 4x или 10x под микроскопом(рисунок 4).
  7. Если плотность посева ниже 90% покрытия или неравномерно распределена, отрегулируйте плотность клеток соответствующим образом и повторите шаги 7,2-7,6 до тех пор, пока не будет достигнута правильная плотность в канале. После подтверждения правильной плотности клеток(рисунок 4),семенных клеток в оставшихся чипах. Чтобы прикрепить клетки к пористой мембране, которая расположена в верхней части нижнего канала, инвертировать каждый чип и отдохнуть в колыбели чипа.
  8. Поместите небольшой резервуар (15 мл конической трубки крышка, содержащая стерильные DPBS) внутри 150 мм блюдо для обеспечения влажности для клеток. Инкубировать чипсы при 37 градусах по Цельсию в течение примерно 3 ч, или до тех пор, пока клетки в нижнем канале не прикрепляются. После того, как iBMECs прикрепили (3 ч после посева), переверните чипы обратно в вертикальное положение, чтобы позволить вложению ячейки в нижней части нижнего канала.

8. Инициирование потока

  1. Поток, как правило, инициируется 48 ч после посева iBMECs. Это время необходимо для iBMECs прикрепить твердо к чипу.
  2. Для поддержания ламинарного потока через чип важно дегазировать и уравновесить температуру среды. Медиум необходимо предварительно прогреть на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
  3. До 50 мл разогретого носителя может быть дегазировано инкубации под вакуумной системой фильтрации в течение 15 минут.
  4. Первое время портативных модулей
    1. Обезвитрить внешний вид портативной упаковки модуля и лотки с 70% этанола, протрите, и передачи в BSC. Откройте пакет и поместите модули в лоток. Ориентируйте их с резервуарами к задней части лотка.
    2. Пипетка 3 мл предварительно уравновешенных, теплых носителей для каждого впускного водохранилища. Добавьте среду культуры EC к впуску резервуара нижнего канала и NDM к верхнему резервуару впуска канала верхнего канала(рисунок 5).
    3. Пипетка 300 л предварительно уравновешенных, теплых носителей для каждого резервуара розетки, непосредственно над каждым портом розетки(рисунок 5).
    4. Поместите до шести портативных модулей на каждый лоток. Принесите лотки к инкубатору и полностью сдвиньте в культурный модуль с ручкой лотка, обращенной наружу.
    5. Выберите и запустите цикл "Prime" на модуле культуры. Закройте дверь инкубатора и позвольте модулю культуры сделать портативные модули (занимает 1 мин). Цикл грунтовки завершается, когда в баре статуса читается "Готов". Удалите лоток из модуля культуры и принесите его в BSC.
    6. Убедитесь, что портативные модули были успешно загрунтования путем проверки нижней каждого портативного модуля в BSC. Ищите наличие мелких капель во всех четырех портах.
      1. Если какой-либо портативный модуль не показывает капель, перезапустите основной цикл на этих модулях. Если какие-либо средства массовой информации капали на лоток (это может произойти чаще выхода портов), чистый лоток с 70% этанола.
  5. Подключение чипов к портативным модулям, регулирование и инициирование потока
    1. Аккуратно мыть оба канала каждого чипа с теплой, уравновешенной клеточной среды культуры, чтобы удалить любые возможные пузырьки в канале и место небольшие капли средств массовой информации (в соответствии с средствами массовой информации в канале) на верхней части каждого впуска и выхода порта.
    2. Вставьте чипы с носителями в портативные модули и поместите до шести на каждый лоток. Вставьте лотки в модуль культуры. Программа соответствующих условий культуры чипа органа (скорость потока и растяжения) на модуле культуры.
    3. Запрограммированные условия начнутся, как только цикл "Регулировать" будет завершен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока для каждого канала может контролироваться независимо и может быть установлена на ставки, которые варьируются от 0-1000 л/ч. Чип BBB обычно культивируется на уровне 30 л/ч. При проточном носителе, таких как EC-носители или ESM при 30 л/ч и 1000 л/ч, силы сдвига составляют 0,01 dyn/cm2 и 0,33 dyn/cm2, соответственно.
    4. Запустите цикл "Регулировать", который занимает около 2 ч, после чего культурный модуль начнет течь в условиях предустановленной культуры чипов органа.

9. Оценка проницаемости параклеточной проницаемости между кровью и мозгом

  1. Подготовка NDM дополнена 10 мкг/мл dextran-FITC (4 kDa). Это решение будет использоваться в качестве ввода для канала «стороны крови».
  2. Заполните резервуары нижнего канала портативных модулей с NDM дополнены dextran-FITC. Заполните верхние резервуары канала с NDM без трассировщика.
  3. Perfuse как, верхний и нижний каналы на скорости потока 30 л/ч, по крайней мере 4 ч, пока достаточно средств массовой информации накапливается, чтобы быть собраны для оценки флуоресценции в плите читателя (обычно 100 л).
  4. Сбор образцов носителей из вхданных и выходных резервуаров верхних и нижних каналов. Защитите образцы от света.
  5. Последовательно разбавить NDM дополнен ы 10 мкг/мл dextran-FITC 1:1 с помощью NDM без трассировщика для создания кривой калибровки 10-12 точек.
  6. Возьмите 100 л каждого образца, включая кривую калибровки, в черную пластину 96 скважин и прочитайте флуоресценцию с помощью считывателя пластин (485 нм возбуждение, 530 нм выбросов).
  7. Используйте измеренные значения для вычисления значенийP-приложений следующим образом:

figure-protocol-21676

  1. Возьмите ежедневные измерения, чтобы оценить барьерные свойства и подтвердить, что чип BBB по-прежнему функционирует.

10. Иммуноцитохимия

  1. Принесите чипсы в химический дым капот. Используя пипетку P200, исправьте клетки, перенапрягая оба канала с 200 qL параформальдегида (PFA) в DPBS и инкубировать в течение 10 минут на RT.
  2. После фиксации, perfuse каждый канал с 200 Зл DPBS и инкубировать в течение 5 мин. Повторите DPBS мытье 2x.
  3. Блокируйте и пермяки клетки на чипе, пронизывающий первичное блокирующее решение (PBS, дополненный 5% нормальной сывороткой осла и 0,1% Triton X-100). Инкубировать на RT за 1 ч.
  4. Разбавить первичные антитела в первичном блокирующем растворе и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия. Маркеры БМЭК: GLUT-1 (1:100 разбавления), ЗО-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) и VE-кадерин (1:200). Нейронные маркеры - Это ЗIII-тубулин (1:1000; Tuj1 " ), S100 "(1:500), nestin (1:1000) и GFAP (1:1000).
  5. Вымойте чипсы 3x с холодной DPBS.
  6. Разбавить вторичные антитела во вторичном блокирующем растворе (DPBS с 5% нормальной ослиной сывороткой без Triton-X).
  7. Perfuse вторичного раствора антитела через оба канала. Как правило, флуоресцентные вторичные антитела разбавляют 1:1000. Инкубировать за 1 ч при РТ защищены от света.
  8. Вымойте чипсы 3x с DPBS.
  9. Ядра ядер из пятен, проникая чипом с 100 злицу раствора DAPI. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
  10. Вымойте чипсы 3x с DPBS.
  11. Чип готов к визуализации с помощью либо вертикальноили или перевернутый флуоресцентный микроскоп. Прозрачность PDMS позволяет делать визуализацию в нетронутом чипе органа. Увеличение выше 10x может потребовать больших рабочих расстояний из-за толщины чипа органа.

Результаты

Рисунок 6A,B,C представляет собой чип BBB, посеянный с эквалайзерами на верхнем канале «мозговой стороны» и iBMECs на «кровавом канале». iBMECs были посеяны первым и позволили прикрепить ночь, после чего эквалайзеры были посеяны. Чипы были затем культивировались в стати?...

Обсуждение

Сочетание технологии органа на чипе и iPSC-клеток в NVU обещает точное моделирование человека BBB. Здесь мы предоставляем подробный протокол для простого и надежного применения недавно опубликованного чипа BBB-16 на основе iPSC. Обзор и сроки парадигмы посева показаны на

Раскрытие информации

Cedars-Sinai владеет миноритарным пакетом акций компании Emulate, которая производит микрофлюидные чипы органа. Сотрудник Cedars-Sinai также входит в состав Совета директоров Emulate. Emulate не оказал агенства финансовой поддержке для этого исследования. Cedars-Sinai и Emulate имеют патенты, поданные в связи с этой работой.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сошану Свендсен за критический монтаж. Эта работа была поддержана ГрантОм Израильского научного фонда 1621/18, Министерством науки и техники (MOST), Израилем 3-15647, Калифорнийским институтом регенеративной медицины, грантом ID DISC1-08800, Фондом семьи Шерманов, грантом NIH-NINDS 1UG3NS105703 и грантом Ассоциации ALS 18-SI-389. AH финансировался Фондом Валленберга (грант No 2015.0178).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseEMD MilliporeSCR005Dissociation solution
B27Gibco12587010
BfgfPeprotech100-18B
Chip-S1Emulate IncChip-S1Organ-Chip
Collagen IVSigmaC5533
DAPIInvitrogenD3571
Dextran-FITCSigma46944
DMEM: F12Thermo Fisher Scientific31330038
Donkey serumSigmaD9663
Emulate Reagent 1 (ER-1)Emulate IncER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2)Emulate IncER-2
FibronectinSigmaF1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)DakoZ0334
GLUT-1InvitrogenMA5-11315
GlutamaxLife Technologies35050038Glutamine supplement
hBDNFPeprotech450-02
KOSRThermo Fisher Scientific10828028
LamininSigmaL2020
MatrigelCorning354234Basement membrane matrix
mTeSR1StemCell Technologies, Inc.85851
NEAABiological industries01-340-1B
NestinMilliporeMAB353
NutriStemBiological industries05-100-1AAlternate media
PECAM-1Thermo Fisher Scientific10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)Biomedical TechnologiesJ64483AB
Retinoic acid (RA)SigmaR2625
S100βAbcamab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter UnitMilliporeSCGP00525
Triton X-100SigmaX100
ZO-1 Monoclonal AntibodyInvitrogen33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α)SigmaT8660
β-mercaptoethanolLife Technologies31350010

Ссылки

  1. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
  2. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  3. Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
  4. El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
  5. Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  6. Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
  7. Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
  8. Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
  9. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
  10. Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
  11. Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
  12. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  13. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
  14. Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
  15. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  16. Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
  17. Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  18. Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
  19. Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
  20. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
  21. Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
  22. Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
  23. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  24. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  25. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  26. Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
  27. Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
  28. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
  29. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
  30. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  31. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
  32. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
  33. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

157BBBOoCNVUiPSCiPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены