JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен протокол, сочетающий очистку тканей с световой микроскопией флуоресценции листа (LSFM) для получения трехмерных и клеточных изображений разрешения лимфатических сосудов и лимфатических узлов (НН), собирающих спинномозговой жидкости (CSF) и спинномозговой эпидуральной жидкости.

Аннотация

Лимфатическая система, связанная с центральной нервной системой (ЦНС), включает в себя лимфатические сосуды, которые вращаются вокруг мозга, спинного мозга и связанных с ним LNs. ЦНС-ассоциированной лимфатической системы участвует в дренаже CSF макромолекулы и менингеальные иммунные клетки к ЦНС-дренажных LNs, тем самым регулируя очистку отходов и иммунного наблюдения в тканях ЦНС. Представлен новый подход для получения трехмерных (3D) и клеточного разрешения изображения CNS-ассоциированных лимфатических при сохранении целостности их схем в окружающих тканях. Протокол iDISCOиспользуется для иммунолабелевых лимфатических сосудов в декальсифицированных и очищенных целых крепостей позвоночного столба, которые впоследствии изображя с помощью светового листа флуоресценции микроскопии (LSFM). Техника показывает 3D структуру лимфатической сети, соединяющей менингеальные и эпидуральные пространства вокруг спинного мозга к внепозвоночным лимфатическим сосудам. Предусмотрены 3D-изображения дренажных схем молекулярных трассировщиков, ранее введенных либо в CSF через цистерна-магну, либо в тораколумбарную спинномозговую паронхиму. Подход iDISCO/LSFMоткрывает беспрецедентные возможности для изучения структуры и функции лимфатической системы, связанной с ЦНС, в нейрососудистой биологии, нейроиммунологии, раке мозга и позвонков, или биологии позвоночных костей и суставов.

Введение

ЦНС окружен CSF и наложения слоев очинок, эпидуральной ткани и костей. В целом, CSF обеспечивает физическую защиту мягкого мозга и спинного мозга. В основном выделяется сосудистое сплетение и менингеальные мембраны (т.е. пиа-матер, арахноид и дура-матер). CSF-менингеальный комплекс также устанавливает функциональный интерфейс между тканями ЦНС и остальной частью тела, тем самым способствуя Гомеостазу ЦНС. Во-первых, CSF проникает в СНС parenchyma через ЦНС пара-артериальных пространств и динамически взаимодействует с интерстициальной жидкости (ISF)1 через глимфатический (glia-лимфатический) системы, которая состоит из параваскулярных пространств и астроцитов конечной ноги мембраны вокруг сосудов ЦНС2,3,4. Метаболические отходы и избыток жидкости затем в конечном счете очищается от внутримурного периваскулярного дренажа непосредственно из мозга parenchyma к системной циркуляции3, а также паравенные пространства к CSF и через мозг-дренаж лимфатических сосудов, в соответствии с глимфатической модели2,4. Отток CSF в основном через лимфатическую систему, через крибриформную пластину и связанные с ними внекраниальные лимфатические сосуды5,,6,,7,а также менингеальные лимфатические сосуды, которые сходятся в мозго-дренажных LNs8,9,10,11,12 (Рисунок 1). Важную, хотя и второстепенную, роль в оттоке CSF играет черепно-мозговая арахноидная вилли, которая проникает в лакуну менингеальных венозных пазух13.

CFS дренажные цепи были тщательно исследованы с помощью экспериментальных подходов, основанных на инъекциях цветных / флуоресцентных трассировщиков в ЦНС или CSF, а затем изображением шаблона трассировщиков внутри ЦНС и по всей части органов и тканей тела в разные временные точки после инъекции13. Долгое время отток CSF считался исключительно и непосредственно принятым ответственным за кровообращение, через арахноидальную вилли, проецирующуюся в дуальные венозные пазухи13. Тем не менее, отток CSF в основном осуществляется лимфатической сосуды, как недавно показали ближнего инфракрасного (NIR) динамическое изображение CSF-инъекционных трассировщик транспорта у мышей9,10. CSF-дренажных лимфатических сосудов затем вернуть лимфы в кровоток через правую подклавиевскую вену. Дополнительные приближения обнаружили как экстракраниальные6,,7,,13 и внутричерепные9,10,11,,12 лимфатических выходов CSF-инъекционных трассировщиков и предположить, что CSF поглощается двумя лимфатическими путями, один внешний, а другой внутренний к черепу и позвоночной колонке. Основная часть дренажа CSF быстро происходит через лимфатические сосуды, расположенные ростралически, вне черепа в слизистой оболочке носа, через каналы крибриформной пластины этилоидной кости3,,6,,13 и, по-настоящему, вне люмбосакральных костей позвонков через дорсо боковой линии, которые еще не полностью охарактеризованы7,,14. Кроме того, в оболочках черепа, лимфатические капилляры dura mater directy поглощают CSF и менингеальные иммунные клетки к дуральным лимфатическим коллекторам, которые пересекают кости черепа и подключаются к ЦНС-дренажных LNs12,14. Эти менингеальные лимфатические сосуды играют важную роль в патофизиологии ЦНС, потому что менингеальная лимфатическая опухоль мозга изменяется при старении, а также влияют на исход неврологических заболеваний головного мозга, включая нейродегенерацию, нейровоспаление и рак мозга15,,16,17. Таким образом, ЦНС-ассоциированных лимфатических сосудов (т.е. дуральных и периферических лимфатических сосудов, осушенных CSF) может быть перспективным новой мишенью для борьбы с болезнями ЦНС у людей.

Конвергентные исследования, проведенные с иммуногистологией и магнитно-резонансной томографией высокого разрешения, показали, что менингеальная лимфатическая вазулатура также существует у приматов, в том числе обычных сурков и людей7,,11,13. Кроме того, менингеальные лимфатические сосуды не ограничиваются черепом, но распространяются в позвоночном столбе на поверхность спинного ганглиев и рами13,,18. Трехмерная (3D) визуализация позвоночного столба лимфатических сохранения общей анатомии помеченных образцов позвонков и позвоночника, в том числе чрезмерной костей, мышц, связок, а также соседних висцеральных тканей, недавно была выполнена14. IDISCOпротокол 19,20 был использован для иммунолабела декалцифицированных и очищенных препаратов всего позвоночного столба с лимфатическими специфическими антителами против либо мембранного рецептора LYVE121 или транскрипционного фактора PROX122. Приобретение изображений и анализ были затем проведены с помощью светового листа флуоресценции микроскопии (LSFM) и программного обеспечения Imaris. LSFM позволяет быстро и минимально инвазивных 3D изображений крупных образцов осевого заключения освещения, что приводит к снижению фотоблесы и фототоксичности23.

Подход iDISCO/LSFMпозволяет охарактеризовать различные слои дураловых и эпидуральных лимфатических сосудов, а также связь этого сосуда с внепозвоночными лимфатическими цепями и LNs, соседствующим с позвоночным столбом. Протокол был применен к тканям, ранее вводившие флуоресцентные трассировщики для демонстрации дренажа позвоночного канала. В настоящем документе содержится+подробная информация о методологии iDISCO /LSFM для изображения лимфатических сосудов позвонка и иллюстрирует его отношение к CSF и эпидуральной жидкости дренаж исследования.

протокол

Все инво-процедуры, используемые в данном исследовании, соответствовали всем соответствующим этическим нормам для тестирования и исследований на животных, в соответствии с Европейским сообществом для экспериментальных руководящих принципов использования животных (L358-86/609EEC). Исследование получило этичное одобрение Комитета по этике INSERM (n'201611111126651) и Институциональным комитетом по уходу за животными ICM (Институт дю Серво и де ла Мель Эпиньер).

1. Подготовка

  1. Подготовьте следующие инструменты вскрытия для хирургии: скальпель (1), микросилы (2), щипцы (1), ножницы для вскрытия и зажимы для швов Мишеля. Приготовьте 26 Г игл (0,45 мм х 13 мм), 1 мл шприца и 10 микросыля.
  2. Потяните микрокапилляры с одноступенчатым протоколом при 67,5 градусов по Цельсию со стеклянным шкивом микропиппетом. Подготовьте два микрокапилляра на инъекцию.
  3. Подготовка реагентов для визуализации лимфатического дренажа(Таблица 1): Ovalbumin Alexa Fluor 555 конъюгации (OVA-A555, 2 мг/мл в 1x фосфат буферный солевой раствор »PBS) и анти-LYVE1 антитела (1 мг/мЛ в 1x PBS).
  4. Подготовка антител (Таблица 1) для iDISCO. Для первичных антител используйте анти-LYVE1 поликлональные антитела кролика (1:1,600) и анти-PROX1 козы поликлональные антитела IgG (1:2,000). Для вторичных антител, используйте Alexa Fluor осла анти-кролик-568, осел анти-кролик-647, и осел анти-коза-647 (1:2,000).

2. Хирургические процедуры для внутрисистрных инъекций (ICM) и тораколумара (ThLb)

  1. Подготовка животного к операции
    1. Используйте взрослых самцов и самок C57BL6/J мышей, 8-12 недель.
    2. Введите мышь интраперитонально (IP) с 0,015 мг/мЛ бупренорфин раствором, разбавленным в 0,9% хлорида натрия на 0,1 мг/кг, за 15 мин до операции.
    3. Обезболивать мышь в индукционной коробке с 2-3% изофлуран газа.
  2. Приготовление обезболивающего животного для инъекции трассировщика
    1. Поместите анестезируемую мышь и ее гремяю на стереотаксический аппарат. Используйте ушные прутья, чтобы держать голову мыши, и сложить тело под углом 135 "к голове или обездвижить спинной мозг на уровне позвонка ThLb (Th12-L1) с спинномозговой адаптер. Pinch хвост или лапу с forcep, чтобы проверить эффективность анестезии.
    2. Впрысните IP 200 л 0,9% хлорида натрия для гидратации мыши.
    3. Используя лезвие скальпеля, сделайте разрез кожи, либо в затылочной области к области шейки матки для инъекции ICM, или на уровне позвонка ThLb (Th10-L3) для инъекций в ThLb спинного паренхима.
  3. Инъекция Tracer
    1. Откажитесь от парацервических и параспинальных мышц, покрывающих шею и колонку, чтобы визуализировать поверхность дюра-матер, внешнего слоя оболей.
    2. Тщательно пунктуировать центральную область дюра-матер и подледить арахноид 26 G иглой.
    3. Имплантация микрокапиллярий
      1. Вырежьте 2 мм стеклянного наконечника капилляров (см. шаг 1.2), затем используйте микрокапилляр, подключенный к канюле, связанному с 10-х мл шприца, чтобы аспирировать 2х8 л антител OVA-A555 или LYVE1.
      2. Введите микрокапилляр в медиальной области dura mater под углом 30 "для инъекций ICM или 10 " угол для инъекций позвоночника ThLb, и нажмите его в 1,5 мм ниже dura mater.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Связки проколоты, но ламинэктомия не выполняется.
      3. Добавьте 10 мл хирургического клея, чтобы закрыть разрез вокруг стекло капилляра и ждать, пока он высохнет.
    4. Медленно введите флуоресцентный трассировщик на 1 л/мин. После того, как объем инъекций был доставлен, поддерживать капилляр на месте в течение 1 мин. Втягивайте микрокапилляр и добавьте хирургический клей, чтобы закрыть отверстие для инъекций.
  4. Постинджекции, закрыть разрезы кожи с швом клипы. Снимите мышь с стереотаксикозерного аппарата и поместите ее в камеру послегермегового потепления при 37 градусов по Цельсию, пока она не восстановится.

3. Перфузия и вскрытие тканей

  1. На 15 мин или 45 мин после инъекции трассировщика CSF, вводят ИС смертельную дозу (100 мл) пентобарбитала натрия. Pinch хвост или лапу, чтобы убедиться, что нет рефлекса.
  2. Ножницами вскрытия вырежьте кожу и откройте перитонеальный слой из нижней части живота в сторону грудной клетки. Откройте грудную клетку ножницами, чтобы иметь доступ к сердцу.
  3. Вставьте 26 G иглы в левом желудочке сердца и начать перфузыки с 20 мл ледяной 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS на 2 мл / мин. Используйте ножницы, чтобы быстро сократить правое предсердие и освободить поток перфузии жидкости.
  4. Полностью снимите кожу щипцами и вырежьте четыре ноги ножницами. Удалите все внутренние органы, но будьте осторожны, чтобы сохранить LNs нетронутыми.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Mandibular LNs являются поверхностными, поэтому заботиться, чтобы не удалить их при отрезании кожи. Глубоко шейные LNs (dcLNs) расположены по обе стороны трахеи, в контакте с боковой поверхностью внутренних яремных вен и близко к мышцам стереомастоида.
  5. Отрежьте ребра для удаления позвоночного столба со спинным мозгом внутри от шейки матки до поясничных сегментов.
  6. Погрузите расчлененные ткани в ледяной 4% PFA в 1x PBS в 50 мЛ трубки на ночь (18 ч) при температуре 4 градуса Цельсия. Вымойте фиксированные ткани 3x в 50 мл 1x PBS в течение 5 мин.

4. Флуоресценция макроскопии позвоночного сегмента

  1. Расположите образец под флуоресценционным стереозомным микроскопом с помощью камеры(Таблица материалов). Пройдите обзор образца или увеличьте масштаб конкретного региона.

5. Образец препарата для всего крепления иммуносумирования

  1. Используя лезвие микротома, поперечно вырезать столб головы и позвонков на уровне затылочной и шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это рассечение позволяет изолировать голову и область шейного позвонка от остальной части позвоночного столба.
  2. С помощью микротомного лезвия, вырезать шейки матки, тораколумбар, и сакральных областей позвоночного столба поперечно в сегменты 2'4 позвонков, около 0,5 см размер каждого.
  3. Изолировать каждый сегмент в порядке, он был отделен от оси позвонков, по всей длине шейного и грудного области позвоночника. Храните каждый образец в трубке 2 mL 1x PBS.

6. iDISCO- целый монтаж иммуносументирования позвоночного сегмента

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описаниепротокола iDISCO доступно по адресу http://www.idisco.info.

  1. День 1: Обезвоживание тканей
    1. Обезвоженные образцы позвоночной ткани (т.е. сегмент позвонков) путем последовательного погружения в 20%, 40%, 60%, 80% и 100% метанола в 1x PBS на 1 ч с агитацией.
    2. Инкубировать образцы на ночь в растворе 33% метанола/66% дихлорметана (ДСМ) при комнатной температуре (РТ) с агитацией.
  2. День 2: Отбеливание тканей
    1. Вымойте образцы 2x со 100% метанолом на 1 ч в RT. Инкубировать образцы в 5% H2O2 в метаноле (30% H2O2 и метанола 1:5 v/v) при 4 градусах по Цельсию в одночасье.
  3. День 3: Шаг декальцификации и пермяки
    1. Регидратировать образцы постепенно в 80%, 60%, 40%, 20% метанола, затем в 1x PBS (1 ч в каждом растворе) на RT с агитацией.
    2. Decalcify позвонков путем инкубации образцов в растворе Морзе (10% трисодий цитрат и 45% формиановой кислоты 1:1 v/v) в течение 30 мин на RT для сохранения костной структуры.
    3. Промыть образцы 2x с 1x PBS и инкубировать 2x на 1 ч в растворе PTx2 (0.2% Triton X-100 в 1x PBS, возобновить для второй инкубации) на RT с агитацией. Затем инкубировать предварительно проинстреченные образцы в пермяке (PTx2 с 20% диметил сульфоксида (DMSO) и 2,3% w/v глицин) при 37 градусах по Цельсию на 24 ч.
  4. День 4: Блокирование шаг
    1. Инкубировать образцы в блокируем растворе (PTx2 с 6% сывороткой осла и 10% DMSO) при 37 градусах по Цельсию на 24 ч.
  5. Дни 5–16: иммуномаркирование всего крепления
    1. Инкубировать образцы первичных антител, разбавленных в PTwH (1x PBS, содержащий 0,2% Tween-20 и 0,1% гепарина при 10 мг/мл в 1x PBS) с 5% DMSO/3% сыворотки осла при 37 градусов по Цельсию в течение 6 дней. Вымойте образцы 4х5x в PTwH на RT с агитацией на ночь.
    2. Инкубировать образцы вторичного разбавления антител в PTwH с 3% сыворотки осла при 37 градусов по Цельсию в течение 4 дней. Вымойте образцы в PTwH 4'5x на RT под агитацией на ночь перед очисткой.
  6. Дни 17 и 18:+ iDISCO
    1. Обезвоживание образцов постепенно путем последовательного погружения в 1x PBS, то 20%, 40%, 60%, 80%, и 2x в 100% метанола (1 ч в каждом растворе). Инкубировать каждый образец на ночь в растворе 33% метанола/66% DCM.
    2. Вымойте 2x в 100% DCM в течение 15 минут, чтобы удалить метанол. Инкубировать в dibenzyl эфира (DBE) без встряхивания до очищены (4 ч), а затем хранить в DBE на RT перед визуализацией.

7. LSFM изображений

  1. Изображение очистили образцы в поперечном самолете с LSFM оснащен 4x/0.3 цели.
    1. Используйте одностороннюю конфигурацию трехлистного освещения, фиксированную позицию x (без динамической фокусировки). Используйте светодиодные лазеры, настроенные на 561 нм, 100 мВт; и 639 нм, 70 мВт. Установите числовой диафрагму светового листа до 30%.
    2. Используйте различные фильтры выбросов: 595/40 для Alexa Fluor-568 или -555, и -680/30 для Alexa Fluor-647.
  2. Заполните камеру микроскопа DBE.
  3. Aquire стеки с 2,5 мкм z шаги и 30 мс время экспозиции за шаг с камерой (Таблица материалов). Используйте оптический зум x2 для эффективного увеличения (x8), 0,8 мкм/пиксель, и выполняйте мозаичные приобретения с 10% перекрытием на полном кадре.
  4. Приобретайте изображения в формате .tif с программным обеспечением для приобретения и преобразуйте их в 3D-формат с программным обеспечением для преобразования файлов.
  5. Реконструкция мозаичных приобретений с стежком программного обеспечения (Таблица материалов). Откройте изображения и двигайтесь вручную, чтобы воссоздать всю мозаичную картину, используя 10% перекрытия между изображениями в качестве ориентира.
  6. Используйте 3D-программное обеспечение(Таблица материалов)для создания ортогональных проекций данных, как показано на рисунке 1, Рисунок 2, Рисунок 3, и рисунок 4, и добавить атрибут цветового кода лимфатических сосудов и других анатомических структур на дисплее. Установите гамма-коррекцию 1,47 к необработанным данным, полученным от LSFM в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты

3D-изображение лимфатической сосудов позвонка
На рисунке 1 представлены шаги процедуры iDISCO/LSFMи изображение LSFM лимфатических цепей внутри позвоночного канала iDISCO-обработанные позвонки ThLb. Сочетание iDISCO+ с LSFM сохранило анатомию позвонков и захватило вид лимфатической сосудистой сети (т.е. внутрипозвонковых сосудов, соединенных с внепозвоночными сосудами, выходяными из спинной и позвоночной части) в окружающих костях, связках, мышцах и нервных ганглиях.

Флуоресценция макроскопии изображения dcLN дренаж
Для того, чтобы изображение макромолекула дренажа в ЦНС-ассоциированной лимфатической системы, макромолекулярные трассировщики были администрированы in vivo путем инъекций в либо CSF или спинного parenchyma. Макромолекулярный трассировщик может быть легко доставлен в CSF на цистерна magna. Цистерна-магна расположена между мозжечоком и спинной поверхностью продолговатой медуллы, над фораменом магнумом. Макромолекулярный трассировщик также может быть введен в спинномозговой паренхимы стереотаксической хирургии на различных уровнях вдоль позвоночника.

Используемые макромолекулярные трассировщики были либо непосредственно помечены фторфором, либо обнаружены посмертными иммуногистохимией с конкретными антителами. Рисунок 2A иллюстрирует экспериментальный план для отслеживания OVA-A555, красный флуоресцентный и небольшой молекулярный вес трассировщик (около 45 кДа), который был введен либо в CSF (Рисунок 2B) или ThLb области спинного мозга (Рисунок 2C).

На 45 мин после инъекции макромолекулярного трассировщика, мыши были принесены в жертву, проникнуты 4% PFA, и обработаны, чтобы изолировать расчлененные сегменты стволовой области мозга головы и позвоночного столба, которые были decalcified и уточнены. Макромолекуль дренаж был затем легко оценены флуоресценции макроскопии изображений LNs, которые собирают CSF и эпидуральных жидкостей. Как показано на рисунке 2, OVA-A555 инъекции либо в CSF(Рисунок 2B) или ThLb(Рисунок 2C) области спинного мозга привело к OVA-A555 накопления в dcLNs на 45 мин после инъекции. Это наблюдение указывает на поглощение и дренаж флуоресцентного трассировщика лимфатической системой; это является необходимым условием, прежде+чем проводить процедуру iDISCO /LSFM для изображения позвоночного лимфатического дренажа.

3D-изображение макромолекуле дренажа в лимфатической системе позвонков
На основании обнаружения маркировки OVA-A555 в dcLNs, процедура iDISCO/LSFMможет быть применена к декалькодистским и предварительно расчленяющим образцам позвонков, выделенным из OVA-A555-инъекционных мышей. Такой подход позволил создать 3D-карту лимфатического дренажа CSF и спинного эпидуральной жидкости в определенный момент времени после инъекции трассировщика. Это 3D-картографирование может выполняться путем визуализации последовательных сегментов ЦНС, на каждом уровне позвоночного столба, от точки инъекции.

Рисунок 3A показывает экспериментальный дизайн для инъекций OVA-A555 в спинномозговой паренхиме ThLb и результирующую 3D-модель распределения OVA-A555 в сегменте шейки матки и грудного позвонка в сочетании с лимфатической сосудокулярной системой. На 45 мин после инъекции OVA-A555, OVA-A555 накопление было обнаружено в тканях спинного мозга и dcLNs (белые стрелки на рисунке 3B), в согласии с микроскопом наблюдений, иллюстрированных на рисунке 2. Он не был обнаружен, однако, в цервикальной и грудной лимфатической сосуды помечены анти-LYVE1 антител. Отсутствие CSF-инъекционного трассировщика в лимфатических сосудах позвонков может быть связано либо с коротким временем сохранения трассировщика внутри лимфатических сосудов, либо с отсутствием поглощения трассировщика лимфатическими сосудами(рисунок 3C).

Для того чтобы испытать первую гипотезу, антитело кролика anti-LYVE1 было использовано как лимфатическая endothelial бирка клетки для того чтобы связать CNS-ассоциированные лимфатические сосуды. Впрыснутое антитело кролика anti-LYVE1 в дальнейшем было обнаружено иммуногистохимией с anti-кроликом вторичным антителом, пока лимфатические эндотелиальные клетки были immunolabeled с антителами anti-PROX1. Рисунок 4 представляет собой экспериментальную конструкцию анти-LYVE1 инъекции в ThLb спинного паренхима (Рисунок 4A), и в результате 3D распределение модели LYVE1 антител в сегменте ThLb близко к месту инъекции, в отношении PROX1и лимфатической(рисунок 4B). Оба позвонков лимфатических и их внепозвонковых лимфатических связей были помечены инъекционные анти-LYVE1 антитела, которые обосновали трассировщик поглощения позвоночных лимфатических сосудов и лимфатического дренажа к внепозвоночной лимфатической системы. В регионе ThLb отсутствовали LNs, и, таким образом, их нельзя было визуализировать в изображенный сегмент. Кроме того, прерывистая картина маркера LYVE1 наблюдается вдоль лимфатических сосудов, вероятно, отражает прерывистое выражение LYVE1 в лимфатических сосудах, как сообщалось в предыдущих исследованиях14,21. В целом, результаты настоящего исследования показали, что на 45 мин после инъекции трассировщика, антитела LYVE1, но не OVA-A555, позволили обнаружить местного позвоночного лимфатического поглощения и предпочитали OVA-A555 в качестве постоянного маркера местного позвоночного лимфатического дренажа.

figure-results-6196
Рисунок 1: Трехмерное представление лимфатической сосуда позвонка. (A) Схемаическое представление протокола. (B) Планар проекция 3D зрения ThLb позвоночных лимфатических сосудов с дорсофронтальной точки зрения. Лимфатические сосуды были иммуномаркированные с анти-PROX1 антитела (зеленый) с использованием протоколаiDISCO, а затем изображен LSFM. Обратите внимание на метамерическую картину сосудов в позвоночном канале трех последовательных позвонков (белые наконечники стрел). В дополнение к полукруглым спинным сосудам (белые наконечники стрел), каждая позвоночная сеть включала в себя вентраальные ветви (желтые стрелки), двусторонние боковые пути выхода вдоль спинальной рамы и ганглиев (белые стрелы), а также спинной путь выхода на средней линии (белая двойная стрелка). Позвоночные сети были соединены продольным сосудом (фиолетовыми стрелками). Для полного описания см.18 Звездочка и вентральный позвоночный корпус; D и спинной; L и боковой; V - вентральный; Масштабные бары No 300 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7591
Рисунок 2: dcLNs собраны OVA-A555-помечены CSF жидкостей. (A) Схема экспериментального проектирования. OVA-A555 был введен либо в ICM или ThLb спинного паренхима, то мышей были принесены в жертву 45 минут после инъекции. Образцы были очищены и соблюдены флуоресценции макроскоп изображения (B,C). Флуоресценция макроскоп изображения цервывных позвонков из ICM- (( B) и ThLb-(C) вводили мышей. Обратите внимание, что OVA-A555 накапливается в dcLNs(B,C, белые наконечники стрел), пиальные и парасосудистые пространства шейного и параваскулярного пространства шейного мозга(B,C) и после инъекции ICM, в желудокулярных маршрутах выхода, вероятно, вдоль шейных нервов(B, белые стрелки). СК и спинной мозг. Звездочка и вентральный позвоночный корпус; D и спинной; L и боковой; V - вентральный; Масштабные бары в B и C 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-8978
Рисунок 3: Обнаружение OVA-A555-помеченных жидкостей CSF в лимфатической системе позвонков. (A) Схема экспериментального проектирования. OVA-A555 был введен в ThLb спинного parenchyma, то мышей были принесены в жертву на 45 мин после инъекции. Образцы были обработаны с протоколом iDISCOи изображены с LSFM. (B,C) Планарные прогнозы LSFM-захваченных лобных 3D просмотров шейки матки (B) и грудной (C) сегментов позвоночника. Накопление OVA-A555 (красный) было обнаружено в тканях спинного мозга и dcLNs(B,белая стрелка), как показано на рисунке 2, но не в шейном и грудном лимфатическом сосуде иммунобеля здесь с анти-LYVE1 антитела (зеленый). СК - спинной мозг; Звездочка и вентральный позвоночный корпус; D и спинной; L и боковой; V - вентральный; Шкала баров 1 мм (B), 300 мкм (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-10305
Рисунок 4: Обнаружение позвоночного лимфатического дренажа после внутриспионного введения антител против LYVE1. (A) Схема экспериментального проектирования. Анти-LYVE1 антитела были введены в ThLb спинного паренхима, то мышей были принесены в жертву 45 минут после инъекции. Образцы были обработаны с протоколом iDISCOи изображены с LSFM. (B). Планар прогнозы лобных 3D просмотров ThLb (B) позвоночника сегмента, захваченных с LSFM. Антитела против ЛИВЕ1 были обнаружены с анти-кроличьими антителами (фиолетовыми) и лимфатическими сосудами с антителами PROX1 (зелеными). Белые сосуды PROX1и лимфатические колеи с анти-LYVE1 антител (B); к ним относятся позвоночные (желтые стрелки) и экстрапозвоночные (двойные желтые стрелки) лимфатические. СК - спинной мозг; Звездочка и вентральный позвоночный корпус; D и спинной; L и боковой; V - вентральный; Масштабные батончики 300 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

РеагентовЦелевойРисунокШаг протоколаКомментарий
OVA-A555 Трассировщик CSFРисунок 2 и рисунок 32. инъекция ICM или ThLb
7. LSFM изображений.		Водорастворимый, легкий в введении и высокая интенсивная флуоресценция
Анти-Lyve1 антителаМембранный маркер LVs-клетокРисунок 36. iDISCO' цельная гора immnunostaining.
7. LSFM изображений.		Эффективное антитело к всему монтумнуностания
Трейс дренаж дуральных и эпидуральных LVsРисунок 42. инъекция ICM или ThLb
6. iDISCO ' весь монтаж immnunostaining
7. LSFM изображений
Антитела Anti-Prox1Ядерный маркер ЛВ-клетокРисунок 1 и рисунок 46. iDISCO ' весь монтаж immnunostaining
7. LSFM изображений		Эффективное антитело к всему монтумнуностания

Таблица 1: Антитела и трассировщики, используемые в исследовании.

ПроблемаВозможная причинаРешение
Хирургия для инъекции трассировщикаНежелательные повреждения тканей ЦНС1. Отсутствие контроля над вставкой капилляров стекла
2. Неправильная глубина вставки капилляров стекла		1. Punctate с осторожностью, но полностью, dura mater с 26 G иглы до вставки капилляров стекла.
2. Уменьшите глубину вставки капилляров (Зтт;1,5 мм от дюра-матер).
3. Уменьшить диаметр капилляров стекла.
Нежелательное осквернение инъекционного трассировщика в эпидуральные или экстрапозвоночные пространстваНеправильная инъекция трассировщика1. Проверьте, если стекло микро капилляр был хорошо вставлен в пунктуировать dura mater.
2. Добавить хирургический клей между стеклом микрокапиллярий и окруженных тканей перед введением трассировщика.
Чрезмерный объем инъекционного трассировщикаУменьшите объем вводимого трассировщика (Зтт;2 л.).
иммуносу бухгалтерское функционирование iDISCOОтсутствие, неоднородность или чрезмерный фон маркировки в ткани1. Проблемы с концентрацией первичного антитела
2. Недостаточная пермяка
3. Недостаточное мытье
4. Недостаточная очистка		Увеличьте количество и/или время инкубационных шагов: проницаемости, whashing, первичного антитела и очистки. Смотрите http://www.idisco.info (ЧАСТО И TROUBLESHOOT).
Недостаточная декалькификацияИспользуйте более строгую обработку декальцификации образца с EDTA21 или Морзе решение для тканей головы особенно.
Очистка iDISCOОбразцы непрозрачны или коричневого цветаНедостаточное отбеливаниеИспользуйте свежий раствор H2O2, увеличьте объем и/или время инкубации.
Наличие окисленияЗаполните трубку полностью, чтобы избежать присутствия воздуха.
Недостаточная очисткаУвеличение объема и/или инкубации. Смотрите http://www.idisco.info (ЧАСТО И TROUBLESHOOT).
Обнаружение TracerНеобнаруживаемый трассировщикНеправильная комбинация выбранного трассировщикаAlexa 555, 594 и 647 фторхромы устойчивы к протоколу iDISCO5,6,7,8,9,10. Однако, это не относится к FITC, GFP, флюорохром RFP.
Точка времени жертвоприношения после инъекцииПредпочитают OVA-A555 для краткосрочного (15 мин) дренажного анализа в местных позвоночных лимфатических. Для анализа дренажа лимфатических узлов антитела OVA-A555 и Lyve1 могут быть использованы для более длительного анализа .
Изображение: захват и анализЗахваченные изображения лимфатической цепи не являются удовлетворительнымиПроблема вскрытия (лимфатические узлы отсутствуют)Включите тщательно позвонков / черепа соседних тканей в расчлененный образец, в соответствии с лимфатической цепи, что вы хотите изображение.
Проблема с изображением1. Изменение параметров приобретения LSFM: интенсивность лазера, световой лист численной диафрагмы, толщина светового листа, время экспозиции.
2. Поместите образец в поддержку, чтобы уменьшить путь, пройденный светом через ткани до цели.
3. Убедитесь, что есть нет пузырьков внутри образца ткани во время приобретения.

Таблица 2: Рекомендации по устранению неполадок для каждого шага протокола, включая возможные проблемы и решения.

Обсуждение

Протокол iDISCO/LSFMобеспечивает беспрецедентное 3D-виды лимфатической сети, связанной с ЦНС, в окружающих ее тканях на клеточном уровне разрешения. Этот протокол хорошо адаптирован к образцам среднего размера, не exeeding 1,5 см3, из-за ограничений оптической системы LSFM, сокращение рабочего расстояния, и большой размер коммерческих объективных линз для микроскопии высокого разрешения23. Это ограничение предотвращает захват всей лимфатической системы, связанной с мозгом. Важно отметить, что область исследования должна быть осторожно делимитированных и тканей, окружающих ЦНС должны быть тщательно расчленены для того, чтобы включить экстракраниальных лимфатических сосудов и LNs, которые способствуют всей лимфатической схемы (Таблица 2).

В дополнение к размеру и анатомическим соображениям, сложность окружающих мезенхимальных тканей варьируется вдоль черепа и позвоночного столба, что требует адаптации декалькации и предварительной очистки для того, чтобы получить однородное уточнение образца и обеспечить распространение светового луча в мягкой изотропной биологической ткани. При отсутствии костей, LFSM визуализации тканей головного или спинного мозга не требует стадии декалькификации, и окончательное разрешение захваченных изображений является оптимальным19. Вышеупомянутый протокол, который включает в себя мягкий шаг декальцификации с решением Морзе, хорошо адаптирован для LSFM изображения позвоночного столба, как показано на рисунке 1 и рисунок 4. В отличие от этого, область шеи отображает особенно сложную анатомию костей в дополнение к нескольким слоям мышц, жира и железистых тканей, которые снижают качество захваченных изображений LSFM, как это отражено в рисунке 3B. Таким образом, LSFM-изображение области шеи и шейки матки может быть улучшено путем более строгого лечения тканей; например, с EDTA, как ранее сообщалось24. Таким образом, шаг декалькификации имеет решающее значение, и условия декалькификации должны быть предварительно протестированы для каждого антитела, используемого перед началом полногопротокола iDISCO(Таблица 2).

В то время+как протокол iDISCO /LSFM позволяет получить 3D-вид соединительных цепей между менингеальными и эпидуральными пространствами и связанными с ними LN, прямой количественный анализ лимфатических сосудов из LSFM-захваченных изображений не представляется возможным по следующим причинам: 1) разграничение лимфатических схем сосудов является ненадежным из-за прерывистой картины лимфатического маркера выражение, потому что membranar LYVE1 является ежетерогно распределены21 и PROX1 имеет ядерную модель выражения22; 2) неоднородное проникновение антител, а также анисотропии, которые могут сохраняться в биологической ткани из-за неполной и неоднородной декалькации и предварительной очистки. Таким образом, изображение LSFM должно быть расширено с помощью инструментов виртуальной реальности, которые позволяют интерактивную визуализацию и тем самым облегчают количественную оценку лимфатической сосудов (www.syglass.io). Примечательно также, что точное описание связанных с ЦНС схем требует резервного копирования информации LSFM с конфокальными данными высокого разрешения, полученными путем обычного иммуномаркирования на тонких (5-10 мкм) криостата или парафин-встроенных секций ткани, особенно для точной локализации положения лимфатических сосудов в отношении dura mater и CSF, как сообщалось ранее11,14,18.

Протокол iDISCO/LSFMпозволяет трехмерную визуализацию макромолекулярного дренажа в лимфатической системе, связанной с ЦНС, как показано на рисунке 3 и на рисунке 4. Тем не менее, функциональная оценка лимфатического дренажа требует, в дополнение к рекомендациям по iDISCO/LSFMпротокол подробно описано выше, после строгой процедуры, как конечный результат зависит от качества инъекционной хирургии, выбор места доставки, тип и вводили объем макромолекула маркера используется, и время жертвоприношения после администрирования трассировщика ( Таблица2). Из-за вариаций схемы трассировки между инъекционными животными, характеристика лимфатических дренажных схем требует больших экспериментальных групп ('gt;10 по состоянию инъекции). В представленном протоколе, 1) дюра-матер должны быть проколоты перед инъекцией, чтобы предотвратить нежелательные поражения и проникновение в ткани ЦНС; 2) вводимый объем должен быть меньше 2 мл, чтобы ограничить нежелательное диффузию через отверстие для инъекций, вдоль капилляра инъекций, в эпидуральное пространство или экстрапозвоночный ткани; 3) глубина инъекций капиллярной вставки должна быть ограничена 2 мм ниже dura mater, чтобы избежать травмы ЦНС или mistargeting в ICM и интраспинальных инъекций, соответственно. Отметим также, что для оценки наличия инъекций внутри лимфатических сосудов необходимо провести дополнительный конфокальный анализ соседних сегментов позвонков с высоким разрешением. Этот анализ требует установления интенсивности профиль участков для трассировщика и лимфатического маркера на поперечных участках маркера помечены лимфатических сосудов. Этот подход был ранее использован для демонстрации OVA555 поглощения ThLb лимфатических на 15 минут после инъекции (Дополнительный рисунок 5F в Иаков и др.14). Тем не менее, он не был проиллюстрирован для анти-LYVE1 трассировщик в настоящем исследовании (Рисунок 4).

Среди возможных трассировщиков CSF, OVA-A555 является отличным вариантом, поскольку он устойчив кпроцедуре протокола iDISCO и поддерживает высокую флуоресценцию для LSFM изображений. Однако обратите внимание, что тип трассировщика должен быть выбран в соответствии с. точкой времени анализа(Таблица 1 и Таблица 2). Как сообщалось выше, OVA-A555 маркировки местных позвонков лимфатических сосудов наблюдается на 15 мин после инъекции14. Тем не менее, OVA-A555 больше не обнаруживается в этих местных лимфатических цепях на 45 мин после инъекции(рисунок 3) в отличие от анти-LYVE1 антитела(Рисунок 4).

В заключение следует,+что протокол iDISCO /LSFM хорошо адаптирован для исследования 3D-структуры и дренажа лимфатической системы, связанной с ЦНС, в физиологических и патологических состояниях, таких как ЦНС и рак позвонков, или заболевания позвонков и суставов. Хотя полная процедура является длительной и требует методологической строгости, она предоставляет ценную, уникальную информацию при использовании с дополнительным анализом с использованием инструментов виртуальной реальности и конфоцальной визуализации высокого разрешения.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом Санте и де ла Рехерш Медикал, Национальное агентство Рехерче (ANR-17-CE14-0005-03), Федерация за recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (в L.J.), Федеральный университет де Рио-де-Джаньеро (UFRJ для J.B.), NIH (R01EB016629-01) и йельский университет медицины. Мы признаем платформы ICM: ICM-КВАНТ для клеточной визуализации и ИСМ-гистамики для иммуногистохимии. Все работы с животными велись на объекте PHENO-ICMice. Ядро поддерживается 2 "Инвестиции d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 и ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) и "Фонд за recherche M'ddicale". Мы признательны Николя Ренье за методологические советы и чтение рукописей.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Centrifuge tubes: 0.2mlEppendorf30124359
Centrifuge tubes: 2mlEppendorf30120094
Conical centrifuge tubes: 15mlFalcon352096
Conical centrifuge tubes: 50mlFalcon352070
Microtome blade 80mmMicrom Microtech FranceF/MM35P
Needles 26G (0.45x13 mm)TerumoAN*2613R1
Syringe 1mlTerumoSS+01H1
Microscopes and imaging softwares
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS cameraZeiss
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software)Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software)OXFORD instruments
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayionCOHERENT
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6)LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti RabbitThermo FisherA10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goatJackson ImmunoResearch705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti RabbitJackson ImmunoResearch711-605-152
Anti-LYVE1 polyclonal antibodyAngiobio#11-034
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibodyR&D systems#AF2727
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml)AnimalcareAmpule 1ml
Dibenzyl Ether 100% (DBE)Sigma Aldrich108014
Dichloromethane 100% (DCM)Sigma Aldrich270997
Formic acid 99%CARLO ERBA405793
GlycineSigma AldrichG.7126
Heparine sodium salt from porcineSigma AldrichH4784
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%)Sigma AldrichH1009
Isoflurane (Iso-Vet 100%)PiramalNDC 66794-013-10
Methanol 100%Sigma Aldrich322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 ConjugateInvitrogen11549176
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X)EuromedexET330-A
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL)Dechra08718469445110
Tri-sodium citrateVWR6132-04-3
Surgical tools and equipments
Anaesthesia systemUniventorUniventor 410 Anaesthesia Unit
Glass micropipette pullerNarishigePC-10
Heating padCMA Microdialysis ABCMA 450 Temperature controller
Microcapillaries (Glass Capillaries)Harvard ApparatusGC120-15
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm)Fine Science Tool12040-01
Scalpel (sterile disposable scalpel 23)Swann-Norton0510
Stereotaxic apparatusKOPFModel 940
Syringe Hamilton 10µl 701NHamilton28618-U
Warm air SystemVet-Tech LTDHE011

Ссылки

  1. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  2. Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Implications of the discovery of brain lymphatic pathways. The Lancet Neurology. 14 (10), 977 (2015).
  3. Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
  4. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
  5. Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
  6. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
  7. Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  10. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  11. Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
  12. Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  13. Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9 (2010).
  14. Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
  15. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  16. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  17. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  18. Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738 (2017).
  19. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  20. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  21. Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  23. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: a tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159iDISCO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены