Imaging tridimensionale della vascolatura e del drenaggio linfatico vertebrale utilizzandoiDISCO e microscopia a fluorescenza del foglio di luce

Riepilogo

Viene presentato un protocollo che combina la compensazione dei tessuti con la microscopia a fluorescenza del foglio di luce (LSFM) per ottenere immagini a risoluzione tridimensionale e cellulare dei vasi linfatici e dei linfonodi (LN) che raccolgono il liquido cerebrospinale (CSF) e il fluido epidurale spinale.

Abstract

Il sistema linfatico associato al sistema nervoso centrale (CNS) include la vascolatura linfatica che ruota intorno al cervello, al midollo spinale e alle GN associate. Il sistema linfatico associato al CNS è coinvolto nel drenaggio delle macromolecole CSF e delle cellule immunitarie meningeali verso LN drenante del CNS, regolando così lo sdoganamento dei rifiuti e la sorveglianza immunitaria all'interno dei tessuti del SNC. Presentato è un nuovo approccio per ottenere immagini tridimensionali (3D) e a risoluzione cellulare di linfotici associati al CNS, preservando l'integrità dei loro circuiti all'interno dei tessuti circostanti. Il protocollo^iDISCO - viene utilizzato per immuno-etichettare i vasi linfatici in preparazioni di montaggio intere decalcificate e cancellate della colonna vertebrale che vengono successivamente immagini con microscopia a fluorescenza del foglio di luce (LSFM). La tecnica rivela la struttura 3D della rete linfatica che collega gli spazi meningiali ed epidurali intorno al midollo spinale ai vasi linfatici estratebrali. Fornite sono immagini 3D dei circuiti di drenaggio dei traccianti molecolari precedentemente iniettati nel CSF tramite la cisterna magna o il parenchyma spinale toracacolumbar. L'approccio^iDISCO/ LSFM offre opportunità senza precedenti per esplorare la struttura e la funzione del sistema linfatico associato al SNC nella biologia neurovascolare, neuroimmunologia, cancro cerebrale e vertebrale, o biologia delle ossa vertebrali e delle articolazioni.

Introduzione

Il CNS è circondato dal CSF e sovrappone strati di meningi, tessuto epidurale e ossa. Complessivamente, il CSF fornisce protezione fisica al cervello morbido e al midollo spinale. È principalmente secreto dal plesso coroideo e dalle membrane meningeali (cioè, il pia mater, l'aracnoide e il dura mater). Il complesso CSF-meningeal stabilisce anche un'interfaccia funzionale tra i tessuti del SNC e il resto del corpo, contribuendo così all'omeostasi del SNC. In primo luogo, il CSF penetra il parenchyma CNS attraverso gli spazi para-arteriali del CNS e interagisce dinamicamente con il fluido interstiziale (ISF)¹ attraverso il sistema glifatico (glia-linfotico), che consiste negli spazi paravascolari e nelle membrane astrocite dei piedi finali intorno ai vasi CNS^2,3,4. I rifiuti metabolici e il liquido in eccesso vengono quindi eliminati dal drenaggio perivascolare intramurale direttamente dal parenchyma cerebrale verso la circolazione sistemica³, così come gli spazi paravenosi verso il CSF e tramite vasi linfatici che drenanti di cervelli, secondo il modello glifatico^2,4. Il deflusso cscranico avviene principalmente attraverso il sistema linfatico, attraverso la piastra cribriforme e i vasi linfatici extracranici^{associati 5,6,7}, nonché dai vasi linfatici meningiali, che convergono alle LN^8,9,10,11,12 ( Figura1). Un ruolo importante, anche se secondario, nel deflusso cslfante è assunto dai villi aracnoidi cranici, che penetrano nella lacuna dei seni venosi meningeali¹³.

I circuiti di drenaggio CFS sono stati ampiamente studiati attraverso approcci sperimentali basati sull'iniezione di traccianti colorati/fluorescenti nel CNS o CSF, seguiti dall'imaging del modello dei traccianti all'interno del SNC e in tutti gli organi e tessuti del corpo in diversi punti di tempo^{dopo l'iniezione 13}. Per lungo tempo, il deflusso di CSF è stato considerato esclusivamente e direttamente preso in carico dalla circolazione sanguigna, attraverso villi aracnoidi che si proiettano in seni venosi durali¹³. Tuttavia, il deflusso csF è prevalentemente eseguito dalla vascolatura linfatica, come recentemente dimostrato dall'imaging dinamico nel vicino infrarosso (NIR) del trasporto del tracer iniettato da CSF nei^{topi 9,10}. I vasi linfatici che drenano il CSF restituiscono quindi la linfa al flusso sanguigno attraverso la vena subclaviana destra. Le approchini complementari hanno rilevato sia le uscite extracraniali^6,7,13 e intracranica^9,10,11,12 uscite linfatiche di traccianti iniettati da CSF e suggeriscono che il CSF viene assorbito da due vie linfatiche, una esterna e l'altra interna al cranio e alla colonna vertebrale. La parte principale del drenaggio CSF avviene rapidamente attraverso vasi linfatici situati rostralmente, al di fuori del cranio nella mucosa nasale, attraverso canali della piastra cribriforme dell'osso ethmoide^3,6,13 e, caudally, al di fuori delle ossa vertebrali lumbosacral attraverso percorsi dorsolaterali che non sono ancora completamente caratterizzati^7,14. Inoltre, nelle meningi del cranio, i capillari linfatici della dura mater directy assorbono CSF e meningeal immunosorveglia verso collettori linfatici durali che attraversano le ossa del cranio e si connettono a LN^12,14. Questi vasi linfatici meningeali svolgono un ruolo importante nella fisiopatologia del SNC, perché i linfatici meningiali del cervello sono alterati dopo l'invecchiamento e hanno anche un impatto sull'esito di malattie neurologiche del cervello, tra cui neurodegenerazione, neuroinfiammazione e cancro al^{cervello 15,16,17}. Pertanto, la vascolatura linfatica associata al CNS (cioè i vasi linfatici durali e periferici che drenano il CSF) può essere un nuovo promettente obiettivo per combattere le malattie del SNC nell'uomo.

Studi convergenti condotti con immunohistologia e risonanza magnetica ad alta risoluzione hanno dimostrato che la vascolatura menfaciale linfatica esiste anche nei primati, comprese le scimmie marmoset comuni e gli^{esseri umani 7,11,13}. Inoltre, i vasi linfatici meningeali non sono limitati al cranio, ma si estendono all'interno della colonna vertebrale fino alla superficie dei gangli spinali e rami^13,18. L'imaging tridimensionale (3D) dei linfatici della colonna vertebrale che preservano l'anatomia complessiva dei campioni vertebrali e spinali etichettati, tra cui ossa sovrastico, muscoli, legamenti e tessuti viscerali vicini, è stata^{recentemente eseguita 14}. Il protocollo^{iDISCO 19},^{20 è}stato utilizzato per immunoegitti decalcificato e eliminato i preparati dell'intera colonna vertebrale con anticorpi linfatici specifici contro il recettore della membrana LYVE1²¹ o il fattore di trascrizione PROX1²². L'acquisizione e l'analisi delle immagini sono state quindi effettuate con la microscopia a fluorescenza del foglio di luce (LSFM) e il software Imaris. LSFM consente l'imaging 3D rapido e minimamente invasivo di grandi campioni mediante confinamento assiale dell'illuminazione, che si traduce in una riduzione della fotosliccatura e della fototossicità^23.

L'approccio^iDISCO/LSFM consente la caratterizzazione degli strati distinti di vasi linfatici durali ed epidurali, e la connessione di questa vascolatura ai circuiti linfatici estrani e alle LN vicine alla colonna vertebrale. Il protocollo è stato applicato ai tessuti precedentemente iniettati con traccianti fluorescenti per dimostrare il drenaggio del canale vertebrale. Il presente documento fornisce dettagli⁺sulla metodologia iDISCO /LSFM per l'immagine della vascolatura linfatica vertebrale e ne illustra la rilevanza per il CSF e l'indagine sul drenaggio dei fluidi epidurali.

Protocollo

Tutte le procedure in vivo utilizzate in questo studio hanno rispettato tutte le normative etiche pertinenti per la sperimentazione e la ricerca sugli animali, conformemente alla Comunità europea per le linee guida sperimentali sull'uso degli animali (L358-86/609EEC). Lo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato Etico dell'INSERM (nè 2016110111126651) e dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).

1. Preparazione

1. Preparare i seguenti strumenti di dissezione per l'intervento chirurgico: bisturi (1), microforza (2), forbici di dissezione e clip di sutura Michel. Preparare aghi da 26 G (0,45 mm x 13 mm), siringhe da 1 mL e 10 microsyringe da 10 G.
2. Tirare i microcapillari con un protocollo monomotore a 67,5 gradi centigradi con un puller di micropipette in vetro. Preparare due microcapillari per iniezione.
3. Preparare i reagenti per l'imaging del drenaggio linfatico(tabella 1): Ovalbumin Alexa Fluor 555 coniugato (OVA-A⁵⁵⁵, 2 mg/mL in 1x fosfato tamponato saline [PBS]) e anticorpo anti-LYVE1 (1 mg/mL in 1x PBS).
4. Preparare gli anticorpi (Tabella 1) per iDISCO⁺. Per gli anticorpi primari, utilizzare anticorpi policlonali anti-LYVE1 coniglio (1:1.600) e anticorpo policlonale IgG di capra anti-PROX1 (1:2.000). Per gli anticorpi secondari, utilizzare Alexa Fluor asino anti-coniglio-568, asino anti-coniglio-647, e asino anti-capra-647 (1:2,000).

2. Procedure chirurgiche per iniezioni intra-cisterna magna (ICM) e toracolumbar (ThLb)

1. Preparazione dell'animale per l'intervento chirurgico
   1. Utilizzare topi adulti maschi e femmine C57BL6/J, di età 8-12 settimane.
   2. Iniettare il topo intraperitonealmente (IP) con 0,015 mg/mL soluzione di buprenorfina diluita in cloruro di sodio 0,9% a 0,1 mg/kg, 15 minuti prima dell'intervento chirurgico.
   3. Anestetizzare il topo in una scatola di induzione con gas isoflurane del 2-3%.
2. Preparazione di animali anetiti per l'iniezione di tracciante
   1. Posizionare il mouse anetitato e il suo pad di riscaldamento sull'apparato stereotassico. Utilizzare le barre dell'orecchio per tenere la testa del topo, e deporre il corpo ad un angolo di 135 dollari alla testa o immobilizzare il midollo spinale a livello vertebrale ThLb (Th12-L1) con un adattatore spinale. Pizzicare la coda o la zampa con la forcep per verificare l'efficienza dell'anestesia.
   2. Iniettare l'IP 200 L dello 0,9% di cloruro di sodio per l'idratazione del topo.
   3. Utilizzando una lama di bisturi, fare un'incisione cutanea, sia nella regione occipitale verso la regione cervicale per l'iniezione ICM, o a livello erche ThLb (Th10-L3) per l'iniezione nel parenchyma spinale ThLb.
3. Iniezione di tracer
   1. Scartare i muscoli paracervicali e paraspinali che coprono il collo e la colonna per visualizzare la superficie del dura mater, lo strato più esterno delle meningi.
   2. Punire con cura l'area centrale del dura mater e sottosottergia con un ago da 26 G.
   3. Impianto microcapillario
      1. Tagliare 2 mm della punta capillare di vetro (c'è il punto 1.2), quindi utilizzare il microcapillario collegato a una cannula collegata a una siringa da 10 lL per aspirare 2/8 L dell'anticorpo OVA-A⁵⁵⁵ o LYVE1.
      2. Introdurre il microcapillario nella regione mediale del dura mater ad un angolo di 30 gradi per le iniezioni di ICM o 10 gradi per le iniezioni spinali ThLb, e spingerlo a 1,5 mm sotto il durate.
         NOTA: Il legamento viene forato, ma non viene eseguita la laminectomia.
      3. Aggiungere 10 L di colla chirurgica per chiudere l'incisione intorno al capillare di vetro e attendere che si asciughi.
   4. Iniettare lentamente il tracciante fluorescente a 1 L/min. Una volta che il volume di iniezione è stato consegnato, mantenere il capillare in posizione per 1 min. Ritirare il microcapillario e aggiungere la colla chirurgica per chiudere il foro di iniezione.
4. Postinizione, chiudere le incisioni cutanee con clip di sutura. Togliere il mouse dall'apparato stereotassico e posizionarlo in una camera di riscaldamento postchirurgia a 37 gradi centigradi fino a quando non si riprende.

3. Perfusione e dissezione dei tessuti

1. A 15 min o 45 min dopo l'iniezione di tracciante CSF, iniettare a IP una dose letale (100 l) di pentobarbital di sodio. Pizzicare la coda o la zampa per verificare che non vi sia riflesso.
2. Con le forbici di dissezione, tagliare la pelle e aprire lo strato peritoneale dalla regione dell'addome inferiore verso la gabbia toracica. Aprire la gabbia toracica con le forbici per avere accesso al cuore.
3. Inserire l'ago da 26 G nel ventricolo sinistro del cuore e iniziare a perfuse con 20 mL di paraformaldeide (PFA) ghiacciata (PFA) in 1x PBS a 2 mL/min. Utilizzare le forbici per tagliare rapidamente l'atrio destro e rilasciare il flusso di liquido perfusione.
4. Rimuovere completamente la pelle con le forbici e tagliare le quattro gambe con le forbici. Rimuovere tutti gli organi interni, ma fare attenzione a preservare le LN intatte.
   NOTA: Le LN mandibolari sono superficiali, quindi fai attenzione a non rimuoverle quando tagliano la pelle. Le LN profonde cervicali (dcLAN) si trovano su ogni lato della trachea, a contatto con la superficie laterale delle vene giugulari interne e vicino ai muscoli stereomastoidi.
5. Tagliare le costole per rimuovere la colonna vertebrale con il midollo spinale all'interno dai segmenti cervicali a lombari.
6. Immergere i tessuti sezionati in ghiaccio freddo 4% PFA in 1x PBS in un tubo di 50 mL durante la notte (18 h) a 4 . Lavare i tessuti fissi 3x in 50 mL di 1x PBS per 5 min.

4. Macroscopia della fluorescenza di un segmento vertebrale

1. Posizionare il campione sotto il microscopio stereozoom a fluorescenza con una fotocamera (Tabella dei materiali). Eseguire una panoramica dell'esempio o eseguire lo zoom su un'area specifica.

5. Preparazione del campione per l'immunostaining dell'intero supporto

1. Utilizzando una lama microtoma, tagliare trasversamente la colonna testa e vertebrale a livello occipitale e cervicale.
   NOTA: Questa dissezione consente l'isolamento della testa e della regione vertebrale cervicale dal resto della colonna vertebrale.
2. Con una lama microtome, tagliate le regioni cervicali, toraciche e sacrali della colonna vertebrale trasversalmente in segmenti di vertebre 2/4, di circa 0,5 cm ciascuna.
3. Isolare ogni segmento nell'ordine in cui è stato separato dall'asse vertebrale, lungo l'intera lunghezza delle regioni cervicali e toraciche della colonna vertebrale. Conservare ogni campione in un tubo di 2 mL 1x PBS.

6. iDISCO^- immunostaining intero di un segmento vertebrale

NOTA: la descrizione dettagliata del⁺ protocollo iDISCO è accessibile all'http://www.idisco.info.

1. Giorno 1: Disidratazione dei tessuti
   1. Campioni di tessuto vertebrale disidratato (cioè un segmento vertebrale) da immersione successiva nel 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanolo in 1x PBS per 1 h con agitazione.
   2. Incubare i campioni durante la notte in una soluzione di 33% metanolo/66% diclorometano (DCM) a temperatura ambiente (RT) con agitazione.
2. Giorno 2: Sbiancamento dei tessuti
   1. Lavare i campioni 2x con metanolo 100% per 1 h a RT. Incubare i campioni in 5% H₂O₂ in metanolo (30% H₂O₂ e metanolo 1:5 v/v) a 4 gradi centigradi durante la notte.
3. Giorno 3: Fase di calcificazione e permeabilizzazione
   1. Reidratare gradualmente i campioni nell'80%, 60%, 40%, 20% di metanolo, quindi in 1x PBS (1 h in ogni soluzione) a RT con agitazione.
   2. Decalcificare le vertebre incubando campioni nella soluzione di Morse (10% di citrato trisodio e 45% di acido formico 1:1 v/v) per 30 min a RT per preservare la struttura ossea.
   3. Risciacquare i campioni 2x con 1x PBS e incubare 2x per 1 h nella soluzione PTx2 (0,2% Triton X-100 in 1x PBS, rinnovare per la seconda incubazione) a RT con agitazione. Quindi incubare i campioni pretrattati nella soluzione di permeabilizzazione (PTx2 con 20% di solfuro di dimetile [DMSO] e 2,3% w/v glicina) a 37 gradi centigradi per 24 h.
4. Giorno 4: Passaggio di blocco
   1. Incubare i campioni nella soluzione di blocco (PTx2 con 6% siero d'asino e 10% DMSO) a 37 gradi centigradi per 24 h.
5. Giorni 5-16: Immunolabeling del supporto intero
   1. Incubare campioni in anticorpi primari diluiti in PTwH (1x PBS contenenti 0,2% Tween-20 e 0,1% di epatina a 10 mg/mL in 1x PBS) con 5% DMSO/3% siero d'asino a 37 gradi centigradi per 6 giorni. Lavare i campioni da 4x in PTwH a RT con agitazione durante la notte.
   2. Incubare campioni in diluizioni di anticorpi secondari in PTwH con 3% siero d'asino a 37 gradi centigradi per 4 giorni. Lavare i campioni in PTwH 4x a RT in agitazione durante la notte prima della compensazione.
6. Giorni 17 e 18: iDISCO^{- pulizia} dei tessuti
   1. Disidratare i campioni gradualmente con un'immersione successiva in 1x PBS, quindi 20%, 40%, 60%, 80% e 2x in metanolo 100% (1 h in ogni soluzione). Incubare ogni campione durante la notte in una soluzione di 33% metanolo/66% DCM.
   2. Lavare 2x in 100% DCM per 15 minuti per rimuovere il metanolo. Incubare nell'etere dibenzyl (DBE) senza agitare fino a quando non è stato eliminato (4 h) e quindi conservare in DBE a RT prima dell'imaging.

7. Imaging LSFM

1. Immagine cancellata campioni in un piano trasversale con l'LSFM dotato di un obiettivo 4x/0.3.
   1. Utilizzare una configurazione di illuminazione a tre fogli a lato singolo, posizione x fissa (nessuna messa a fuoco dinamica). Utilizzare laser a LED sintonizzati a 561 nm, 100 mW; e 639 nm, 70 mW. Impostare l'apertura numerica del foglio di luce al 30%.
   2. Utilizzare diversi filtri di emissione: 595/40 per Alexa Fluor-568 o -555 e -680/30 per Alexa Fluor-647.
2. Riempire la camera al microscopio con DBE.
3. Impilare pile con gradini da 2,5 m z e un tempo di esposizione di 30 ms per passo con la fotocamera (Tabella dei materiali). Utilizzare lo zoom ottico x2 per un ingrandimento effettivo di (x8), 0,8 m/pixel ed eseguire le acquisizioni di mosaici con una sovrapposizione del 10% sul fotogramma completo.
4. Acquisire immagini in formato .tif con software di acquisizione e convertirle in formato 3D con un software di conversione di file.
5. Ricostruire l'acquisizione di mosaici con il software di cucitura (Tabella dei Materiali). Aprire le immagini e spostarsi manualmente per ricostituire l'intera immagine a mosaico, utilizzando la sovrapposizione del 10% tra le immagini come linea guida.
6. Utilizzare il software 3D (Tabella dei materiali) per generare proiezioni ortogonali dei dati, come illustrato nella Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4e aggiungere un attributo di codice colore ai vasi linfatici e alle altre strutture anatomiche visualizzate. Impostare una correzione gamma di 1,47 sui dati grezzi ottenuti dal LSFM secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

Imaging 3D della vascolatura linfatica vertebrale
Nella Figura 1 sono presentati i passaggi della procedura iDISCO⁺/ /LSFM e un'immagine LSFM di circuiti linfatici all'interno del canale vertebrale di iDISCO⁺- trattate vertebre ThLb. La combinazione di iDISCO^- con LSFM ha conservato l'anatomia vertebrale e catturato una vista della rete vascolare linfatica (cioè, i vasi intravertebrali collegati con i vasi estranibili che escono dorsalmente e lateralmente dal corpo vertebrale) all'interno delle ossa circostanti, legamenti, muscoli e gangli nervosi.

Macroscopia macro di fluorescenza del drenaggio dcLN
Al fine di immagini di drenaggio macromolecola nel sistema linfatico associato al CNS, i traccianti macromolecolari sono stati administrati in vivo per iniezione nel CSF o nel parenchyma spinale. Un tracciante macromolecolare può essere facilmente consegnato nel CSF presso la cisterna magna. La cisterna magna si trova tra il cervelletto e la superficie dorsale della medulla oblongata, sopra il foramen magnum. Il tracciante macromolecolare può anche essere iniettato nel parenchyma spinale mediante chirurgia stereotassica a diversi livelli lungo la colonna vertebrale.

I traccianti macromolecolari utilizzati sono stati etichettati direttamente con un fluoroforo o rilevati post-mortem dall'immunohistochimica con anticorpi specifici. La figura 2A illustra il piano sperimentale per il monitoraggio dell'OVA-A⁵⁵⁵, un tracciante rosso fluorescente e di peso molecolare piccolo (circa 45 kDa), che è stato iniettato nel CSF (Figura 2B) o nella regione ThLb del midollo spinale (Figura 2C).

A 45 minuti dopo l'iniezione del tracciante macromolecolare, i topi sono stati sacrificati, perfusi con il 4% di PFA, ed elaborati per isolare i segmenti sezionati della regione del gambo cerebrale della testa e della colonna vertebrale che sono stati decalcificati e chiariti. Il drenaggio delle macromolecole è stato quindi facilmente valutato mediante l'imaging a macrocopia a fluorescenza delle LN che raccolgono il CSF e i fluidi epidurali. Come illustrato nella Figura 2, l'iniezione OVA-A⁵⁵⁵ nell'area CSF (Figura 2B) o ThLb (Figura 2C) del midollo spinale ha provocato l'accumulo di OVA-A⁵⁵⁵ nei dcLAN a 45 minuti dopo l'iniezione. Questa osservazione indica l'assorbimento e il drenaggio del tracciante fluorescente da parte del sistema linfatico; è un prerequisito prima⁺di perseguire la procedura iDISCO / LSFM per immagine del drenaggio linfatico vertebrale.

Imaging 3D del drenaggio delle macromolecole nel sistema linfatico vertebrale
Sulla base del rilevamento dell'etichettatura OVA-A⁵⁵⁵ in⁺dcLN, la procedura iDISCO /LSFM potrebbe essere applicata a campioni vertebrali decalcomati e precleare isolati da topi iniettati OVA-A^555. Questo approccio ha permesso la creazione di una mappa 3D del drenaggio linfatico del CSF e del liquido epidurale spinale in un momento specifico dopo l'iniezione di tracciante. Questa mappatura 3D potrebbe essere eseguita mediante l'imaging di segmenti CNS successivi, ad ogni livello di colonna vertebrale, dal punto di iniezione.

La figura 3A mostra la progettazione sperimentale per l'iniezione OVA-A⁵⁵⁵ nel parenchyma spinale ThLb e il conseguente modello 3D di distribuzione OVA-A⁵⁵⁵ in un segmento vertebrale cervicale e toracico, in combinazione con la vascolatura linfatica. A 45 min dopo l'iniezione OVA-A^555, è stato rilevato un accumulo OVA-A⁵⁵⁵ nei tessuti del midollo spinale e nelle dcLN (frecce bianche nella figura 3B),in accordo con le osservazioni al microscopio illustrate nella Figura 2. Non è stato rilevato, tuttavia, nella vascolatura linfatica cervicale e toracica etichettata con anticorpi anti-LYVE1. L'assenza di tracciante iniettato da CSF nei vasi linfatici vertebrali può essere dovuta a un breve tempo di persistenza del tracciante all'interno dei vasi linfatici o alla mancanza di assorbimento del tracciante da parte dei vasi linfatici (Figura 3C).

Per testare la prima ipotesi, l'anticorpo anti-LYVE1 del coniglio è stato utilizzato come etichetta cellulare endoteliale linfatica per legare i vasi linfatici associati al CNS. L'anticorpo anti-LYVE1 del coniglio iniettato è stato successivamente rilevato dall'immunohistochimica con un anticorpo secondario anti-coniglio, mentre le cellule endoteliali linfatiche sono state immunoetichettate con anticorpi anti-PROX1. La figura 4 rappresenta la progettazione sperimentale dell'iniezione anti-LYVE1 nel parenchyma spinale ThLb (Figura 4A) e il modello di distribuzione 3D risultante di anticorpi LYVE1 in un segmento ThLb vicino al sito di iniezione, rispetto a PROX1⁺ - linci ( Figura4B). Sia i linfatici vertebrali che le loro connessioni linfatiche extravertebrali sono stati etichettati da anticorpi anti-LYVE1 iniettati, che hanno motivato l'assorbimento del tracciante da parte dei vasi linfatici vertebrali e il drenaggio linfatico verso il sistema linfatico extravertelier. Le LN erano carenti nell'area ThLb e, pertanto, non potevano essere visualizzate nel segmento con immagine. Inoltre, il modello discontinuo del marcatore LYVE1 osservato lungo i vasi linfatici probabilmente rifletteva l'espressione discontinua di LYVE1 nella vascolatura linfatica, come riportato negli studi^{precedenti 14,21}. Complessivamente, i risultati del presente studio hanno dimostrato che, a 45 minuti dall'iniezione di tracciante, l'anticorpo LYVE1, ma non L'OVA-A^555,ha permesso il rilevamento dell'assorbimento linfatico vertebrale locale ed era preferibile all'OVA-A⁵⁵⁵ come marcatore persistente del drenaggio linfatico vertebrale locale.

Figura 1: vista tridimensionale della vascolatura linfatica vertebrale. (A) Rappresentazione schematica del protocollo. (B) Proiezione planare di una vista 3D della vascolatura linfatica vertebrale ThLb da una prospettiva dorsofrontale. I vasi linfatici sono stati immunoelettici con l'anticorpo⁺ anti-PROX1 (verde) utilizzando il protocollo iDISCO e quindi immagine da LSFM. Si noti il modello metamerico della vascolatura all'interno del canale vertebrale di tre vertebre successive (punte di freccia bianca). Oltre ai vasi dorsali semicircolari (punte di freccia bianche), ogni rete vertebrale comprendeva rami ventrali (frecce gialle), percorsi bilaterali di uscita laterali lungo il rami spinale e gangli (frecce bianche), così come un percorso di uscita dorsale sulla linea mediana (doppia freccia bianca). Le reti vertebrali erano interconnesse con un vaso longitudinale (frecce viola). Per una descrizione completa, vedere Jacob L. et al.¹⁸ SC - midollo spinale; Asterisco - corpo vertebrale ventrale; D - dorsal; L - laterale; V - ventrale; Barre di scala : 300 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: dcLAN raccolti OVA-A^{555-etichettate}CSF Fluids. (A) Schema del progetto sperimentale. OVA-A^{555 è} stato iniettato nel parenchyma spinale OCM o ThLb, quindi i topi sono stati sacrificati 45 minuti dopo l'iniezione. I campioni sono stati cancellati e osservati mediante imaging macroscopio di fluorescenza (B,C). Immagini di macroscopio di fluorescenza di vertebre cervivale da ICM- (B) e ThLb- (C) topi iniettati. Si noti che OVA-A⁵⁵⁵ accumulato nei dcLAN (B,C, punte di freccia bianca), gli spazi piali e paravascolari del midollo spinale cervicale (B,C) e dopo l'iniezione ICM, in vie di uscita ventrolaterale, probabilmente lungo i nervi cervicali (B, frecce bianche). SC - midollo spinale. Asterisco - corpo vertebrale ventrale; D - dorsal; L - laterale; V - ventrale; Barre di scala in B e C : 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rilevamento di fluidi CSF etichettati OVA-A⁵⁵⁵nel sistema linfatico vertebrale. (A) Schema del progetto sperimentale. OVA-A^{555 è} stato iniettato nel parenchyma spinale ThLb, quindi i topi sono stati sacrificati a 45 minuti dopo l'iniezione. I campioni sono stati trattati⁺ con il protocollo iDISCO e con immagine con un LSFM. (B,C) Proiezioni planari di viste frontali 3D catturate da LSFM di segmenti cervicali (B) e toracici (C) della colonna vertebrale. L'accumulo di OVA-A⁵⁵⁵ (rosso) è stato rilevato nei tessuti del midollo spinale e nelle dcLAN (B, freccia bianca), come illustrato nella Figura 2, ma non nella vascolatura linfatica cervicale e toracica immunoscolasta qui etichettata con anticorpi anti-LYVE1 (verde). SC - midollo spinale; Asterisco - corpo vertebrale ventrale; D - dorsal; L - laterale; V - ventrale; Barre di scala: 1 mm (B), 300 m (C). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rilevamento del drenaggio linfatico vertebrale dopo l'iniezione intraspinale di anticorpi anti-LYVE1. (A) Schema del progetto sperimentale. Gli anticorpi anti-LYVE1 sono stati iniettati nel parenchyma spinale ThLb, quindi i topi sono stati sacrificati 45 minuti dopo l'iniezione. I campioni sono stati trattati⁺ con il protocollo iDISCO e con immagine con un LSFM. (B). Proiezioni planari delle viste frontali 3D di un segmento di colonna vertebrale ThLb (B), acquisite con un LSFM. Sono stati rilevati anticorpi anti-LYVE1 con anticorpi anti-coniglio (viola) e la vascolatura linfatica con anticorpi anti-PROX1 (verde). I vasi bianchi sono PROX1^- linfatici coittati con anticorpi anti-LYVE1 (B); questi includono linfatici vertebrali (frecce gialle) e lincitici extratematici (doppie frecce gialle). SC - midollo spinale; Asterisco - corpo vertebrale ventrale; D - dorsal; L - laterale; V - ventrale; Barre di scala: 300 m (B). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagenti	bersaglio	Figura	Passaggio protocollo	Commento
OVA-A555	Tracciante CSF	Figura 2 e Figura 3	2. Iniezione ICM o ThLb 7. imaging LSFM.	Solubile in acqua, facile da iniettare e alta fluorescenza intensa
Anticorpo anti-Lyve1	Marcatore di membrana delle cellule LV	Figura 3	6. iDISCO intero montaggio immnunostaining. 7. imaging LSFM.	Anticorpo efficiente per l'intero montaggio immnunostaining
	Drenaggio tracciante dei LV dural ed epidurali	Figura 4	2. Iniezione ICM o ThLb 6. iDISCO intero montaggio immnunostaining 7. Imaging LSFM
Anticorpo Anti-Prox1	Marcatore nucleare delle cellule LV	Figura 1 e Figura 4	6. iDISCO intero montaggio immnunostaining 7. Imaging LSFM	Anticorpo efficiente per l'intero montaggio immnunostaining

Tabella 1: Anticorpi e traccianti utilizzati nello studio.

	Problema	Possibile motivo	Soluzione
Chirurgia per iniezione tracciante	Lesione tissuosa del SNC indesiderata	1. Mancanza di controllo dell'inserimento capillare in vetro 2. Profondità errata dell'inserimento capillare del vetro	1. Punttare con cura, ma completamente, il dura mater con un ago da 26 G prima dell'inserimento capillare di vetro. 2. Ridurre la profondità dell'inserimento capillare del vetro (<1,5 mm dal dura mater). 3. Ridurre il diametro capillare del vetro.
	Defilement indesiderato del tracciante iniettato negli spazi epidurali o extra-vertebrali	Iniezione errata di tracciante	1. Controllare se il micro capillare di vetro è stato ben inserito nel punctate il dura mater. 2. Aggiungere la colla chirurgica tra il microcapillario di vetro e il tessuto circondato prima di iniettare il tracciante.
		Volume eccessivo di tracciante iniettato	Ridurre il volume del tracciante iniettato (<2 -L).
immunostaining iDISCO	Assenza, eterogeneità o sfondo eccessivo di etichettatura nel tessuto	1. Problemi con la concentrazione dell'anticorpo primario 2. Permeabilizzazione insufficiente 3. Lavaggio insufficiente 4. Compensazione insufficiente	Aumentare il numero e/o il tempo dei passaggi di incubazione: perbilizzazione, whashing, anticorpo primario e compensazione. Vedere http://www.idisco.info (FAQ E TROUBLESHOOTING).
		Decalcificazione insufficiente	Utilizzare un trattamento di decalcificazione più rigoroso del campione con soluzione EDTA21 o Morse per i tessuti della testa in particolare.
Compensazione iDISCO	I campioni sono opachi o marroni	Sbiancamento insufficiente	Utilizzare la soluzione H2O2 fresca, aumentare il volume e/o il tempo di incubazione.
		Presenza di ossidazione	Riempire completamente il tubo per evitare la presenza di aria.
		Compensazione insufficiente	Aumentare il volume e/o il tempo di incubazione. Vedere http://www.idisco.info (FAQ E TROUBLESHOOTING).
Rilevamento tracciante	Tracciante non rilevabile	Combinazione errata del tracciante selezionato	Alexa 555, 594 e 647 fluorocromi sono resistenti al protocollo iDISCO5,6,7,8,9,10. Tuttavia, questo non è il caso per FITC, GFP, fluorochromes RFP.
		Punto di tempo di sacrificio dopo l'iniezione	Preferisci OVA-A555 per l'analisi di drenaggio a breve termine (15 min) nei linfatici vertebrali locali. Per l'analisi del drenaggio dei linfonodi, l'anticorpo OVA-A555 e Lyve1 può essere utilizzato per l'analisi a lungo termine (>45 min).
Imaging: acquisizione e analisi	Le immagini acquisite del circuito linfatico non sono soddisfacenti	Problema di dissezione (mancano i linfonodi)	Includere con attenzione i tessuti vicini vertebrali/teschi nel campione sezionato, in base al circuito linfatico che si desidera immagine.
		Problema di imaging	1. Modificare i parametri di acquisizione del LSFM: intensità laser, apertura numerica del foglio di luce, spessore del foglio di luce, tempo di esposizione. 2. Posizionare il campione nel supporto per ridurre il percorso percorso dalla luce attraverso il tessuto fino all'obiettivo. 3. Assicurarsi che non ci siano bolle all'interno del campione di tessuto durante l'acquisizione.

Tabella 2: Risoluzione dei problemi relativi a ogni fase del protocollo, inclusi possibili problemi e soluzioni.

Discussione

Il protocollo^iDISCO/LSFM fornisce viste 3D senza precedenti della rete linfatica associata al CNS all'interno dei tessuti circostanti a un livello di risoluzione cellulare. Questo protocollo è ben adattato a campioni di medie dimensioni, non esese di 1,5 cm³, a causa delle limitazioni del sistema ottico LSFM, della ridotta distanza di lavoro e delle grandi dimensioni delle lenti obiettivo commerciale per la microscopia ad alta^{risoluzione 23}. Questa limitazione impedisce di catturare l'intero sistema linfatico associato al cervello. È importante notare che l'area di indagine deve essere delimitata con cautela e che i tessuti che circondano il SNC devono essere attentamente sezionati al fine di includere i vasi linfatici extracranici e le LN che contribuiscono all'intero circuitolinfatico (tabella 2).

Oltre alle dimensioni e alle considerazioni anatomiche, la complessità dei tessuti mesenchymal circostanti varia lungo il cranio e la colonna vertebrale, che richiede l'adattamento della decalcificazione e del trattamento preclearing al fine di ottenere un chiarimento del campione omogeneo e consentire la propagazione del fascio di luce all'interno di un tessuto biologico isotropico morbido. In assenza di ossa, l'imaging LFSM dei tessuti cerebrali o del midollo spinale non richiede la fase di decalcificazione e la risoluzione finale delle immagini catturate è^{ottimale 19}. Il protocollo descritto sopra, che include una lieve fase di decalcificazione con la soluzione di Morse, è ben adattato per l'imaging LSFM della colonna vertebrale, come illustrato nelle figure 1 e nella Figura 4. Al contrario, la regione del collo mostra un'anatomia ossea particolarmente complessa oltre a più strati di muscoli, grassi e tessuti ghiandolari, che riducono la qualità delle immagini LSFM catturate, come illustrato nella Figura 3B. L'imaging LSFM del collo e dell'area cervicale può quindi essere migliorato da un trattamento più rigoroso dei tessuti; ad esempio, con EDTA, come riportato in precedenza²⁴. La fase di decalcificazione è pertanto critica e le condizioni di decalcificazione devono⁺ essere verificate in precedenza per ciascun anticorpo utilizzato prima di avviare il protocollo completo iDISCO (Tabella 2).

Mentre il protocollo⁺iDISCO /LSFM consente la generazione di una visione 3D dei circuiti di collegamento tra gli spazi meningei e epidurali e le LN associate, l'analisi quantitativa diretta della vascolatura linfatica dalle immagini catturate da LSFM non è fattibile per i seguenti motivi: 1) la delimitazione dei circuiti linfatici è inaffidabile a causa del modello discontinuo di espressione del marcatore linfatico, perché il membranar LYVE1 è quiterogenamente^{distribuito 21} e PROX1 ha un modello di espressione nucleare²²; 2) la penetrazione eterogenea degli anticorpi, così come l'anisotropia che può persistere nel tessuto biologico a causa della decalcificazione e della preclearizzazione incomplete ed eterogenee. LSFM imaging deve quindi essere esteso da strumenti di realtà virtuale che consentono la visualizzazione interattiva e quindi facilitare la quantificazione della vascolatura linfatica (www.syglass.io). È anche interessante notare che la descrizione precisa dei circuiti associati al CNS richiede il backup delle informazioni LSFM con dati confocali ad alta risoluzione ottenuti mediante l'immunoetichettazione convenzionale su sezioni di tessuto criostati sottili (5-10 m) o di paraffina, in particolare per localizzare con precisione la posizione dei vasi linfatici per quanto riguarda il mater dura e il CSF, come riportato^{in precedenza 11,14,18}.

Il protocollo^iDISCO/LSFM consente la visualizzazione tridimensionale del drenaggio macromolecolare nel sistema linfatico associato al CNS, come illustrato nelle Figure 3 e nella Figura 4. Tuttavia, la valutazione funzionale del drenaggio linfatico richiede, oltre alle⁺raccomandazioni sul protocollo iDISCO / /LSFM descritto in precedenza, seguendo una procedura rigorosa, in quanto il risultato finale dipende dalla qualità dell'intervento di iniezione, dalla scelta del sito di consegna, dal tipo e dal volume iniettato del marcatore macromolecola utilizzato e dal tempo di sacrificio dopo l'amministrazione del tracer (Tabella 2). A causa delle variazioni del modello di tracciante tra gli animali iniettati, la caratterizzazione dei circuiti di drenaggio linfatico richiede grandi gruppi sperimentali (>10 per condizione di iniezione). Nel protocollo presentato, 1) il dura mater deve essere forato prima dell'iniezione per prevenire lesioni indesiderate e penetrazione nei tessuti del SNC; 2) il volume iniettato deve essere inferiore a 2 L per limitare la diffusione indesiderata attraverso il foro di iniezione, lungo il capillare di iniezione, nello spazio epidurale o nei tessuti extravertereli; 3) la profondità dell'inserimento capillare di iniezione deve essere limitata a 2 mm sotto il dura mater per evitare lesioni cnsi o mistargeting in ICM e iniezioni intraspinali, rispettivamente. Si noti inoltre che è necessario eseguire un'analisi confocale complementare ad alta risoluzione dei segmenti vertebrali vicini, come indicato sopra, per valutare la presenza di tracciante iniettato all'interno dei vasi linfatici. Questa analisi richiede di stabilire i grafici del profilo di intensità per il tracciante e il marcatore linfatico su sezioni trasversali di vasi linfatici etichettati con marcatore. Questo approccio è stato precedentemente utilizzato per dimostrare l'assorbimento OVA⁵⁵⁵ da parte dei linfatici di ThLb a 15 minuti dopo l'iniezione (Figura supplementare 5F in Jacob et al.¹⁴). Tuttavia, non è stato illustrato per il tracciante anti-LYVE1 nel presente studio (Figura 4).

Tra i possibili traccianti CSF, OVA-A⁵⁵⁵ è un'opzione⁺ eccellente in quanto è resistente ai trattamenti del protocollo iDISCO e mantiene un'elevata fluorescenza per l'imaging LSFM. Si noti tuttavia che il tipo di traccia deve essere scelto in base al punto di tempo di analisi (Tabella 1 e Tabella 2). Come riportato in precedenza, l'etichettatura OVA-A⁵⁵⁵ dei vasi linfatici vertebrali locali è osservata a 15 min dopo l'iniezione¹⁴. Tuttavia, OVA-A⁵⁵⁵ non viene più rilevato in questi circuiti linfatici locali a 45 min dopo l'iniezione (Figura 3) a differenza dell'anticorpo anti-LYVE1 (Figura 4).

Per concludere, il⁺protocollo iDISCO - / LSFM è ben adattato per studiare la struttura 3D e il drenaggio del sistema linfatico associato al CNS in condizioni fisiologiche e patologiche come il SNC e i tumori delle colonne vertebrali, o malattie vertebrale ossee e articolari. Anche se la procedura completa è lunga e richiede rigore metodologico, fornisce informazioni preziose e uniche se utilizzate con analisi complementari utilizzando strumenti di realtà virtuale e immagini confocali ad alta risoluzione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Centrifuge tubes: 0.2ml	Eppendorf	30124359
Centrifuge tubes: 2ml	Eppendorf	30120094
Conical centrifuge tubes: 15ml	Falcon	352096
Conical centrifuge tubes: 50ml	Falcon	352070
Microtome blade 80mm	Microm Microtech France	F/MM35P
Needles 26G (0.45x13 mm)	Terumo	AN*2613R1
Syringe 1ml	Terumo	SS+01H1
Microscopes and imaging softwares
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera	Zeiss
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software)	Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software)	OXFORD instruments
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion	COHERENT
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6)	LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit	Thermo Fisher	A10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat	Jackson ImmunoResearch	705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit	Jackson ImmunoResearch	711-605-152
Anti-LYVE1 polyclonal antibody	Angiobio	#11-034
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody	R&D systems	#AF2727
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml)	Animalcare	Ampule 1ml
Dibenzyl Ether 100% (DBE)	Sigma Aldrich	108014
Dichloromethane 100% (DCM)	Sigma Aldrich	270997
Formic acid 99%	CARLO ERBA	405793
Glycine	Sigma Aldrich	G.7126
Heparine sodium salt from porcine	Sigma Aldrich	H4784
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%)	Sigma Aldrich	H1009
Isoflurane (Iso-Vet 100%)	Piramal	NDC 66794-013-10
Methanol 100%	Sigma Aldrich	322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate	Invitrogen	11549176
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X)	Euromedex	ET330-A
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL)	Dechra	08718469445110
Tri-sodium citrate	VWR	6132-04-3
Surgical tools and equipments
Anaesthesia system	Univentor	Univentor 410 Anaesthesia Unit
Glass micropipette puller	Narishige	PC-10
Heating pad	CMA Microdialysis AB	CMA 450 Temperature controller
Microcapillaries (Glass Capillaries)	Harvard Apparatus	GC120-15
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm)	Fine Science Tool	12040-01
Scalpel (sterile disposable scalpel 23)	Swann-Norton	0510
Stereotaxic apparatus	KOPF	Model 940
Syringe Hamilton 10µl 701N	Hamilton	28618-U
Warm air System	Vet-Tech LTD	HE011