Изоляция эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от вентрикулярной свободной стены Крысиного Сердца

Резюме

Мы представляем протокол для изоляции эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от крысиных сердец через последовательное пищеварение ткани в буфере пищеварения, сбор клеток от периодических циклов центрифуги, и очистка клеток с использованием анти-крысы CD31 микробусы.

Аннотация

Было показано, что эндокардиальные эндотелиальные клетки (EECs) и коронарные эндотелиальные клетки (CECs) различаются по происхождению, развитию, маркерам и функциям. Следовательно, эти две популяции клеток играют уникальную роль в сердечных заболеваниях. Текущие исследования с участием изолированных эндотелиальных клеток исследуют популяции клеток, состоящие как из EECs, так и из ЦЭк. В этом протоколе излагается метод независимой изоляции этих двух популяций клеток для характеристик и конкретных клеток. После сбора левой и правой стенки желудочка, эндотелиальные клетки с внешней поверхности и внутренней поверхности отдельно освобождаются с помощью раствора буфера пищеварения. Последовательное пищеварение внешней поверхности и внутреннего эндокардиального слоя сохранило разделение двух эндотелиальных популяций клеток. Отдельная изоляция ЕЭК и ЦЭК проверяется еще раз путем выявления маркеров, характерных для каждой популяции. На основе ранее опубликованных одноклеточных РНК профилирования в сердце мыши, Npr3, Hapln1, и Cdh11 экспрессия генов является уникальным для EECs; в то время как экспрессия генов Fabp4, Mgllи Cd36 уникальна для ЦС. Данные qPCR выявили обогащенное выражение этих характерных маркеров в соответствующих образцах, что свидетельствует об успешной изоляции ЕЭК и ЦИК, а также поддержании клеточного фенотипа, что позволяет проводить дальнейший клеточный функциональный анализ.

Введение

В этой статье содержится подробный протокол (измененный из Gladka et al.¹) для вскрытия и последующей изоляции эндокардиальных эндотелиальных клеток (EECs) и коронарных эндотелиальных клеток (CECs) от крысиных сердец. Способность исследовать эти популяции клеток независимо позволило бы исследовать механизмы типа клеток, лежащие в основе различных сердечных заболеваний, которые могли бы служить в качестве потенциальных терапевтических целей. Однако успешный метод самостоятельного сбора популяций этих клеток еще не опубликован.

ЦЭЦ отличаются от EECs в отношении их происхождения, маркеров и функций во время развития сердца и болезни^{11,22,3,4,,5,,6,7}. EECs вытекают из брюшной поверхности сердечного мезодерма³. Они возникают из клеток-прародителей Flk1^в ответ на сигнализацию VEGF и HIF и образуют внутренний слой трех дискретных областей развивающегося сердца: предсердий, желудочка и синусового вена^3,6. Отслеживание генетической линии предполагает, что плюрипотентные эндокардиальные клетки синусовой веносвых венозных клеток, которые мигрируют в форме субэпикардиального слоя³. Впоследствии субэпикардиальный слой дифференцируется в коронарных артериях и венах, в том числе CECs, которые остаются через периферийные стенки желудочков^3,4. Этот эндокардиальный эндотелиальный путь регулируется VEGFC, ELA/APJ и SOX17 сигнализации^3,4,,6,,8,9. Желудочковый эндокардий получает меньше ЦЭк межжелудочковой перегородки неизвестным механизмом³. Впоследствии локализованная дифференциация между EECs и CECs предлагается маркерами, специфичными для этих двух популяций клеток, включая Mgll, Fabp4 и выражение Cd36 в ЦЭК, или Npr3, Cdh11 и Hapln1 выражение в EECs^3,5,10.

EECs и CECs играют различные роли в сердечной функции. Эндокардиальный к мезенхимальному переходу, формированию клапанов, периоду камерного созревания, регулированию оттока тракта и развитию атриовентрикулярного канала зависит от EECs^6. Кроме того, ЦЭК способствуют вазомоторному тону и воспалению коронарных артерий^11. Эти отклонения в функции приводят к индивидуальной роли в развитии болезни^4,12. Например, данные свидетельствуют о том, что неисправность EECs может привести к врожденному заболеванию клапана⁶, безумство миокарда⁶, атриовентрикулярной секторной перегородки эффект⁶, эндокардиальный фиброэластоз¹³, гипопластический синдром левого сердца¹³, желудочковой гипоплазии¹³, и сердечной гипертрофии¹². Аналогичным образом, исследования показали, что ненормальные CECs способствовать ишемической болезни сердца¹⁴ и тромбоз¹¹.

Успешная изоляция EECs и CECs необходима для достижения всеобъемлющих знаний об этих двух популяциях клеток, которые могут быть использованы как в исследованиях, так и в клинических условиях. Определение факторов роста и дифференциации этих популяций клеток даст рекомендацию для дифференциации эндотелиальных подтипов от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Кроме того, полная идентификация отклонений в развитии, регулировании и функции EECs и CECs имеет жизненно важное значение для понимания геномных и эпигеномных факторов, ответственных за многочисленные заболевания сердца в клеточном типе-специфическим образом. В этой статье излагаются шаги для успешного сбора EECs и CECs независимо, и предоставляет доказательства разделения путем оценки уровня экспрессии генов клеточных типконкретных маркеров.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Административной группой по уходу за лабораторными животными (APLAC31608) Стэнфордского университета.

1. Подготовка буферов

1. Подготовьте буфер пищеварения с помощью реагентов, перечисленных в таблице 1.
   1. Подготовка DNase I фондовых решение: Растворите DNase I в RNase воды для фондового решения 2000 единиц / мл (1 мг /мл). Aliquot и хранить складе раствора при -20 градусах Цельсия.
   2. Подготовка раствора liberase: Растворите liberase с rNase-свободной водой для разрешения штока 5 мг/мл. Поверните его на роликовой банке при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Aliquot и храните складраствор при -20 градусов по Цельсию.
2. Подготовьте сортировочный буфер путем разбавления 0,5 М этиленденеамитететраацетической кислоты (ЭДТА) и 10% раствора сыворотки сыворотки крупного рогатого скота (BSA) с 1x фосфатным буферным сольниковым раствором (PBS) для конечной концентрации 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA.

2. Коллекция сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Шесть крыс Sprague Dawley весом 50-100 г были использованы в этом протоколе. Не наблюдалось никаких гендерных различий.

1. Эвтанизировать крысу с CO₂ и поместить ее в положение на спине на рассекающей платформе. Прикрепите конечности вниз и стерилизовать живот и грудь с 70% этанола.
2. Откройте живот ножницами и вставьте 21 G иглу в часть задней полы вены, расположенной за кишечником. Потяните шприц поршень обратно, снятие крови из вены, пока печень появляется светлее в цвете и не больше крови могут быть сняты, что свидетельствует о достаточном удалении крови.
3. Используя ножницы, откройте грудь тщательно, чтобы избежать повреждения легких и сердца. Поднимите арку аорты / атриум с щипками и сократить аорты, легочной артерии, легочных вен, и вены полы освободить и удалить сердце.
4. Вымойте сердце с 50 мл холодного 1x Хэнкс 'сбалансированный солевой раствор (HBSS) буфер 3x, чтобы удалить чрезмерную кровь.
5. Под микроскопом микродиссекции, удалить правый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM)(Рисунок 1A,B).
   1. Положите сердце на его льстить, заднее лицо, чтобы определить левую и правую сторону.
   2. Найдите легочную артерию, самую переднюю вену и артерии, разветвляющиеся с верхней части сердца, и прорежьте легочную артерию до правой желудочковой камеры. На передней стороне сердца, вырезать вдоль перегородки до достижения вершины. Продолжить резки с вершины до задней стороне сердца вдоль перегородки до легочной артерии и правой желудочковой камеры точки соединения(рисунок 1A).
   3. Начиная с легочной артерии и правой точки соединения желудочка, вырезать как переднюю и заднюю сторону сердца перпендикулярно к предыдущему вскрытию и от перегородки, пока правая стенка желудочков освобождается от остальной части сердца (Рисунок 1B).
6. Под микроскопом микродиссекции, удалить левый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей DMEM(Рисунок 1C,D).
   1. Найдите аорту, ветвящийся от верхней части сердца за легочной артерией, и повторите метод, описанный в шаге 2.5, чтобы отрезать левую стенку желудочка.

3. Пищеварение ЕЭК

1. Поместите как правый, так и левый желудочковые свободные стены ткани в 60 см культуры блюдо с внутренней поверхностью лежал плоский, лицом вниз(Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя поверхность является внутренней поверхностью слегка вогнутой формы желудочка, как показано на рисунке 2A,C.
2. Добавьте в блюдо 0,5-1 мл буфера пищеварения, поместив кончик пипетки прямо под ткань. Продолжайте, пока не будет погружена только внутренняя поверхность.
3. Инкубировать блюдо в 5% CO_2,37 КС инкубатор в течение 5 мин.
4. Добавить EC среде в культуре блюдо, чтобы остановить пищеварение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите количество буфера пищеварения к среде EC как коэффициент 1:5.
5. Используйте 1 мл пипетки, чтобы промыть внутреннюю поверхность желудочков с помощью EC среды и перенести стока в трубку сбора 50 мл через 40 мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению.

4. Пищеварение ЦИК

1. Вырезать вдоль внешней поверхности левого желудочка без загрязнения от внутреннего слоя(рисунок 2B,D) и поместите каждый в отдельной трубке 5 мл, содержащей 1 мл буфера пищеварения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Левый желудочек можно определить как более толстый желудочек, а внешняя поверхность может быть определена как внешняя грань слегка вогнутого желудочка.
2. Используя рассечение ножницами, фарш стенки желудочка в малых, 1 мм³ штук.
3. Инкубировать трубку в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15-20 мин. Вортекс каждые 2-3 мин.
4. Пипетка 4 мл EC среды в 5 мл трубки для прекращения пищеварения.
5. Перенесите раствор с серологическим пипеткой 5 мл в трубку 50 мл через 40-мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению.

5. Коллекция клеток

1. Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), а затем аспирации супернатанта.
2. Если гранулы появляются красными, resuspend гранулы в 1-2 мл 1x красных кровяных телец (РБК) lysing буфера(рисунок 2F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если НЕТ РБК, перейдите к шагу 6.
3. Инкубировать трубки в водяной бане 37 градусов в течение 5 мин.
4. Пипетка 10 мл PBS в 50 мл труб, чтобы остановить лиза.
5. Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта.

6. Сортировка ЕС

1. Добавьте 90 кЛ сортирующего буфера и 10 зл анти-CD31 PE антитела в 50 мл труб.
2. Vortex трубки, а затем инкубировать их в течение 10 минут в холодильнике 4 кс.
3. Добавьте 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешайте, а затем центрифугу при 300 х г в течение 10 минут на RT.
4. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в 80 злител сортировожного буфера и 20 Зл анти-PE микробусов.
5. Вихрь трубки и инкубировать при 4 кв КС в течение 15 мин.
6. Вымойте клетки, добавив 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешать, а затем центрифуги их на 300 х г в течение 10 минут на RT.
7. Призадыхать супернатант и resuspend гранулы в 500 л сортировки буфера.
8. Поместите столбец, содержащий суперпарамагнитные сферы, в магнитный сепаратор и промыть столбец 3 мл сортирующего буфера.
9. После того, как колонна "остановка потока", пипетка 500 л ячеек подвески в колонны, а затем мыть колонны с сортировочным буфером. Повторите мыть 3x, каждый с 3 мл сортировки буфера(рисунок 2G).
10. Снимите столбцы с сепаратора и поместите их поверх новой трубки коллекции 15 мл.
11. С помощью пипетки добавьте 5 мл среды EC к столбику и продвиайте решение с помощью колонны.
12. Centrifuge коллекции труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта.
13. Извлеките РНК из клеточных гранул образцов ЕЭК и ЦИК с помощью комплекта, следуя инструкциям производителя. Минимум 500 нг РНК могут быть получены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После извлечения РНК образец может храниться при -80 градусов по Цельсию.
14. Обратный транскриб 500 нг РНК, чтобы получить cDNA с помощью случайного грунтовки и комплект, следуя инструкциям производителя.
15. Выполните количественные ПЦР для проверки эндокардиальных и эндотелиальных популяций(рисунок 2H). Последовательность праймерперечислений указана в таблице 2.
    1. Добавьте 5 кДНК ЕЭК или CEC (1 нг/Л) в скважины пластины 384 qPCR. Добавьте кДНК ЕЭК или ЦИК в достаточное количество скважин, чтобы было три скважины на количество грунтовок.
    2. Смешайте 6 qL 2x qPCR SYBR зеленый буфер с 0,5 л из каждого 10 км грунтовки, в том числе как вперед, так и обратной грунтовки, и добавить их в один хорошо соответствующие каждому кандидату гена.
    3. Запечатать пластину с пластиковой пленкой и центрифуги в течение 1 мин при 300 х г на RT.
    4. Поместите пластину в машину qPCR, а затем запустите программу при 95 градусах по Цельсию в течение 3 мин, затем 95 градусов по Цельсию в течение 15 с, а затем 55 градусов по Цельсию в течение 60 с. Повторите последующие два шага в течение 45 циклов.

Результаты

Процесс изоляции ЕЭК и ЦИК описан на рисунке 2. Успешная изоляция ЕЭК и ЦЭК была определена путем оценки наличия панэндотелиальных маркеров клеток, а также маркеров, отличающихся от двух популяций подтипов. Как и предсказывалось, qPCR показал, что по отношению к β-актин, EECs выразил более высокие уровни эндокардиальных маркеров Npr3, Hapln1, и Cdh11 по сравнению с ЦЭк (Рисунок 3A). Аналогичным образом, CECs выразили более высокие уровни коронарных маркеров Fabp4, Mgll, и Cd36 по сравнению с EECs(рисунок 3B). Кроме того, как EECs и CECs выразил пан-EC маркер гена Cdh5, с несколько более высоким уровнем в ЦИК(рисунок 3C).

Рисунок 1: Диаграмма вскрытия сердца. ()Первый разрез сделал, чтобы отделить правый желудочек свободной стенки от перегородки. (B) Второй разрез сделал, чтобы освободить правый желудочек полностью. (C) Первый разрез сделал, чтобы отделить левый желудочек свободной стенки от перегородки. (D) Второй разрез сделал, чтобы освободить левый желудочек полностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Диаграмма настройки пищеварения ЦЭК и EECs и следующий механизм для сортировки клеток. (A) Внутренняя бесплатная желудочковая стенка и (B) внешние желудочковой свободной стенки были (C) погружен в пищеварительной буфер или (D) переваривается в пищеварительном буфере соответственно. (E) Сбор и фильтрация клеточных растворов с последующим (F) красная кровяная клетка (РБК) лиза и (G) магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) с использованием антитела CD31. (h)Очищенные ECs были обработаны для проверки экспрессии генов с помощью qPCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: данные qPCR, подтверждающие изоляцию ЦЭК и EECs. (A) Уровни экспрессии генов маркеров EEC Npr3, Cdh11и Hapln1 в EECs и CECs были количественно в режиме реального времени PCR. (B) Уровни экспрессии генов маркеров ЦИК Mgll, Fabp4, и Cd36 в EECs и CECs были количественно в режиме реального времени PCR. (C) маркер Cdh5 по пан-EC был количественно оценен в EECs и CECs в режиме реального времени PCR. (n No 3 в каждой группе). Бары представляют собой среднее для СЭМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1. Пищеварительный буфер (1,5 мл)
	Фондовый Con.	Заключительный Con.	Объем
Либерасе ТМ	5 мг/мл	0,5 мг/мл	150 ул
Dnase I	1 мг/мл	20 мкг/мл	30 уль
ГЕПЕС	1 M	10 мМ	15 уль
DMEM	-	-	1305 ул

Таблица 1: Рецепт буфера пищеварения.

Таблица 2. Праймер Последовательности
Имя гена	Вперед	Обратный
Npr3	TCCTGCAAATCATGTGGGGTTA	GGAATCTTCCCAGCTCTCC
Cdh11	ГТГААТГККККККТКГГКТГГГ	GTAATTCTGGGGCCCTTGC
Hapln1	CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG	GGGCCATTCAGCTGGTGGATG
Мглл	CCCGGGGCAAAGAC	ГААГАГАГКЦкТГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГ
Fabp4	AGAAGTGGGGTGGCTTCG	АКТКТГАККГАГАГАГАГАГАГАГАГА
Cd36	GCAAACGACTGCGCAGGTCAA	CCCGGTCACTTGGTTCtCTGA
Cdh5	ККАТТАГАГАКАКАККККККККККККККККККККККККККК	TGTGGAACGTGTACTGTTGG
B-актин	TCTGTGTGGATTGGTGGGGCTC	CGGACTCATTACTTCCTGC

Таблица 2: Праймер Последовательности

Обсуждение

ЦЦО и ЕЭК различаются по происхождению, маркерам и функциям и, таким образом, могут играть уникальную роль в развитии и заболеваниях. Существующие протоколы эндотелиальной изоляции клеток ограничиваются макрососудистыми тканями, пренебрегая сбором ЕЭК, тем самым ограничивая изучение функций ЦИК и ЕЭК. Важно, чтобы изолировать и изучить эти две популяции самостоятельно, так как эти знания будут служить ссылкой на дифференциацию iPSCs в CECs и EECs для будущих исследований и облегчить изучение этих популяций клеток для потенциальных терапевтических целей для различных сердечных заболеваний. Этот новый протокол излагает метод изоляции EECs от внутренней поверхности и CECs от внешней поверхности желудочковой свободной стенки взрослых крыс.

В этом протоколе крайне важно очень точно контролировать время каждого шага. Поскольку количество EECs очень ограничено в ткани сердца крысы, мы свели к минимуму время пищеварения внутреннего слоя сердца, чтобы предотвратить повреждение клеток и, что более важно, загрязнение ЦИК. Немедленное добавление среднего решения ЕС для прекращения ферментатической реакции также очень важно для поддержания высокой жизнеспособности клеток. Красный гранулы, следующие за сбором клеток, предполагают наличие большого количества РБК. В зависимости от количества загрязнения РБК, для деградации РБК можно добавить 1-2 мл буфера лисиса РБК. Используя текущий протокол, мы смогли изолировать 10⁵ EECs от шести крысиных сердец. Эти клетки могут быть посеяны на блюдо клеточной культуры для дальнейшего расширения и характеристики.

При подготовке ткани для свободного сбора стены, сердце было промыто HBSS, чтобы удалить большинство оставшихся RBCs. HBSS является рекомендуемой среде из-за его четкого внешнего вида, что позволяет визуализации клеток крови, в отличие от DMED содержащие фенол красный. Состав буфера пищеварения обеспечивает достаточное освобождение эндотелиальных клеток, где фермент пищеварения liberase полоски ткани подвергаются клетки, DNase I удаляет ДНК из мертвых клеток для содействия отслоение клеток, которые могут быть ингибированы клеевого качества ДНК, HEPES буфер балансирует рН, и DMEM является модифицированной базальной среды с более высокой концентрацией аминокислот и витаминов для лучшего поддержания клеток и содержит необходимые для активации кальция.

Согласно одноклеточному секвенированию РНК (scRNA-seq), полученному как от человека^15, так и от сердца мыши^10,было сообщено несколько маркеров, приписываемых конкретным популяциям ЕС. Мы выбрали некоторые из наиболее обогащенных генов для изучения чистоты изолированных EECs (т.е., Npr3, Cdh11, и Hapln1) и EECs (т.е., Mgll, Fabp4, и Cd36). По сравнению с маркерами q-Actin, Npr3, Cdh11и Hapln1 продемонстрировали повышенное экспрессию в EECs по сравнению с ЦИКами. Аналогичным образом, выражение Mgll, Fabp4, и Cd36 маркеров было больше в ЦСПо по сравнению с EECs. Однозначно выраженные маркеры для каждого образца соответствуют маркерам, характерным для EECs и CECs соответственно, что свидетельствует об успешной изоляции.

Однако нынешний протокол не может исключить перекрестное загрязнение между двумя популяциями ЕС во время изоляции, даже при тщательно контролируемом последовательном пищеварении. Таким образом, некоторые маркеры поверхности клеток могут быть применены для дальнейшей очистки. Например, NPR3 обычно маркирует^{эндокардий 10,}в то время как APJ может проследить большинство CECs¹⁶. Поскольку эти два маркера выражены на поверхности клетки, они могут быть использованы для флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), а также антитела, используемые для дальнейшей очистки различных популяций EC. Кроме того, человек¹⁵ и мышь¹⁰ сердце scRNA-seq может подтвердить обогащение Npr3 в EECs, и Cd36 потенциально может быть использован для очистки ЦИК.

В заключение, представленный протокол излагает независимую изоляцию EECs и CECs от крысиного сердца. Всесторонняя идентификация клеточных свойств, включенных путем изоляции клеток, может быть использована для значительных приложений вниз по течению.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080	1M
15ml Tubes	Eppendorf	0030122151
50ml Tubes	Nunc	339652
5ml Tubes	Eppendorf	30119401
ACK Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Anti-CD31 PE	Miltenyi Biotec	130-115-505
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA)	Miltenyi Biotec	130-091-376	10%
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	1855485	For qPCR
DNAse I	Worthington	LK 003172	1 mg/mL in water
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10313021
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)	Lonza	CC-3162	EC Medium
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15575020	0.5 M
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1	Gibco	14025092
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-rad	HSP3805	For qPCR
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
Liberase TM	Sigma Aldrich	5401119001	5 mg/mL
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401	For EC isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-302	For EC isolation
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-rad	MSB1001	For qPCR
Narrow Pattern Forceps	F.S.T	11002-12	For heart harvest
Nylon Sterile Strainer	Falcon	352340	40 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS) X1	Gibco	1001023
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	For qPCR
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1050	For RNA extraction
S&T Forceps - SuperGrip Tips	F.S.T	00632-11	For heart harvest
Strabismus Scissors - Tungsten Carbide	F.S.T	14574-11	For heart harvest
Vannas Spring Scissors - Microserrated	F.S.T	15007-08	For heart harvest