Ядерная миграция в ооците дрозофилы

Резюме

При дрозофилеядро ооцита подвергается микротрубочезависимой миграции во время оогенеза. Здесь мы описываем протокол, который был разработан для отслеживания миграции путем выполнения живой визуализации на камерах яиц ex-vivo. Наша процедура поддерживает яйцеклетки живыми в течение 12 часов для получения многопозиционных 3D-покадровых фильмов с использованием конфокальной микроскопии с вращающимся диском.

Аннотация

Визуализация живых клеток особенно необходима для понимания клеточных и молекулярных механизмов, которые регулируют движения органелл, перестройки цитоскелетов или паттерны полярности внутри клеток. При изучении позиционирования ядра ооцита методы визуализации в реальном времени необходимы для захвата динамических событий этого процесса. Яичная камера дрозофилы представляет собой многоклеточную структуру и отличную модельную систему для изучения этого явления из-за ее большого размера и наличия многочисленных генетических инструментов. Во время среднего оогенеза дрозофилы ядро мигрирует из центрального положения в ооците, чтобы принять асимметричное положение, опосредованное силами, генерируемыми микротрубочами. Такая миграция и позиционирование ядра необходимы для определения осей полярности эмбриона и последующей взрослой мухи. Одной из характеристик этой миграции является то, что она происходит в трех измерениях (3D), создавая необходимость для живой визуализации. Таким образом, для изучения механизмов, регулирующих ядерную миграцию, мы разработали протокол культивирования расчлененных яйцеклеток и выполнения живой визуализации в течение 12 ч путем покадровых приобретений с использованием конфокальной микроскопии со спиннинговым диском. В целом, наши условия позволяют нам сохранять яйцеклетки дрозофилы живыми в течение длительного периода времени, тем самым позволяя визуализировать завершение ядерной миграции в большом количестве образцов в 3D.

Введение

В течение нескольких лет ооцит дрозофилы появился в качестве модельной системы для изучения ядерной миграции. Ооцит дрозофилы развивается в многоклеточной структуре, называемой камерой яйцеклетки. Яйцеклетки охватывают 16 половых клеток (15 клеток-кормилиц и яйцеклетку), окруженных эпителиальным слоем фолликулярных соматических клеток. Развитие яичной камеры было подразделено на 14 стадий(рисунок 1А),в ходе которых яйцеклетка будет расти и накапливать запасы, необходимые для раннего развития эмбриона. При развитии, при реорганизации микротрубочек и асимметричном переносе материнских детерминант, ооцит поляризуется по антеродорсальной и дорсо-вентральной осям. Эти оси определяют последующие оси полярности эмбриона и взрослого человека, возникающие в результате оплодотворения этой яйцеклетки^1. Во время оогенеза ядро принимает асимметричное положение в ооците. На стадии 6 ядро центрируется в клетке. После еще не идентифицированного сигнала, излучаемого задними фолликулярными клетками, который принимается яйцеклеткой, ядро мигрирует к пересечению передней и боковой плазматических мембран на стадии 7(Рисунок 1B)^2,3. Это асимметричное положение требуется для того, чтобы вызвать определение дорсо-вентральной оси.

Рисунок 1:Камеры яиц Drosophila melanogaster. ( A )Фиксированныйовариол от трансгенных мух, экспрессивляющих Fs(2)Ket-GFP, который маркирует ядерные оболочки и ubi-PH-RFP, который маркирует плазматические мембраны. Овариол состоит из развивающихся яйцеклеток на разных стадиях. Созревание увеличивается вдоль передне-задней оси с гермарием на переднем кончике (слева), где находится зародышевая стволовая клетка, и более старой стадией на заднем кончике (справа). (B)Z-проекция живой яйцеклетки методом вращающейся дисковой конфокальной микроскопии на 6 стадии оогенеза (слева), при которой ядро центрируется в ооците. Ядро будет мигрировать, чтобы принять асимметричное положение на стадии 7 (справа) в контакте с передней плазматической мембраной (между яйцеклеткой и клеткой медсестры) и боковой плазматической мембраной (между яйцеклеткой и фолликулярными клетками). Это положение будет стимулировать определение дорсальной стороны и, таким образом, дорсо-вентральной оси яйцеклеточной камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В течение многих десятилетий эта ядерная миграция изучалась на фиксированных тканях путем иммуноокрашивания. Такой подход позволил, в частности, продемонстрировать, что этот процесс зависит от плотной сети микротрубочек^4,5. Совсем недавно мы разработали протокол, предлагающий условия, совместимые с живой визуализацией ооцита в течение нескольких часов, что позволяет динамически изучать этот процесс^6.

Следовательно, впервые мы смогли описать, что ядро имеет предпочтительные и характерные траектории во время своей миграции, одну вдоль передней плазматической мембраны (APM), а другую вдоль боковой плазматической мембраны (LPM) ооцита(Рисунок 2). Эти последние результаты подчеркивают важность протоколов визуализации в реальном времени при изучении динамических процессов, таких как ядерная миграция.

Рисунок 2:Схематическое представление различных путей миграции ядра. На 6 стадии оогенеза яйцеклетка представляет собой крупную клетку с центральным ядром. На этом этапе передне-задняя ось полярности устанавливается с задней/латеральной плазматической мембраной ооцита, контактиим с фолликулярными клетками, а передняя плазматическая мембрана (желтого цвета) контактирует с клетками медсестры^2. Ранее мы сообщали, что ядро может мигрировать либо вдоль передней плазматической мембраны (APM), вдоль боковой плазматической мембраны (LPM), либо через цитоплазму (STAD, прямо в антеродоральную кору)^6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Миграция ядра ооцитов представляет собой явление около 3 ч^6,и до сих пор событие, вызывающее начало фактической миграции, неизвестно. Начало миграции также может быть отложено белковыми мутантами, используемыми для изучения этого механизма. Эти неизвестные переменные мотивировали нас получать изображения в течение длительных периодов времени (10-12 ч). Поэтому важно обеспечить, чтобы ооциты оставались живыми. По мере развития яичной камеры она удлиняется вдоль антеро-задней оси от сферической до эллиптической формы. Это удлинение обусловлено вращением фолликулярных клеток, которое происходит от стадии 1 до стадии 8, перпендикулярной антеро-задней оси^7. Кроме того, трубчатая оболочка мышц с пульсирующим свойством окружает яйцеклетки камеры. Его физиологическая функция заключается в том, чтобы подталкивать развивающиеся фолликулы к яйцеводу непрерывно^8. Чтобы ограничить движения, которые вызывают колебания яичных камер после их рассечения, мы разработали наблюдательную микрокамеру высотой 150 мкм(рисунок 3А). Эта высота незначительно превышает размер фолликула на стадиях 10 и 11. Это значительно ограничивает вертикальные движения образца, сохраняя при этом вращение яйцеклеточной камеры, что приводит к ограниченным дефектам в развитии фолликулов. Затем мы выполняем живую визуализацию в течение 12 часов на расчлененных яйцеклетках с помощью многопозиционных покадровых захватов с использованием конфокального микроскопа со вращающимся диском. Здесь мы описываем наш протокол изучения миграции ядер ооцитов между стадиями 6 и 7.

Рисунок 3:Схематическое изображение камеры наблюдения. (A) (Вид сверху) Точные размеры алюминиевой горки с высотой (A') и окружностью (A'') скважины, пробуренной в середине слайда. (B) (Вид снизу) Крышка, блокирующая скважину, герметизирована к слайду силиконовой смазкой. (C)(Вид сверху) Рассеченные яриоли развиваются в среде визуализации, которая покрыта газопроницаемой мембраной. Галогенуглеродное масло используется для стабилизации мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы проследить за ядерной миграцией и точно оценить траектории в ооците, необходимы маркеры как для ядерной оболочки, так и для плазматической мембраны. С этой целью были выбраны два трансгена, которые имеют высокое соотношение сигнал/шум и не исчезают в ходе живой визуализации. Для маркировки плазматической мембраны рекомендуется использовать P[ubi-PH-RFP], который кодирует домен гомологии Плекстрина (PH) фосфолипазы человека C ∂1 (PLC∂1), слитой с RFP. Этот домен PH связывается с фосфоинозитидом PI(4,5)P2, распределенным вдоль плазматической мембраны ооцита^9. Для ядерной оболочки штамм P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP, где GFP вставлен в ген, кодирующий Drosophila ß-importin, отображает однородный и интенсивный сигнал^10. Молодых мух (1-2 дня) помещают в свежие флаконы, содержащие сухие дрожжи, за 24-48 ч до рассечения яичники.

Для этого анализа в реальном времени кусок алюминия толщиной 1 мм, который не является реактивным для образца, был разрезан на размеры слайда микроскопии. Он имеет отверстие диаметром 16 мм в центре затвора, которое было уравнёно до 0,85 мм. Этот контрбор имеет дополнительное отверстие диаметром 6 мм глубиной 150 мкм(рисунок 3А). Крышка наклеивается силиконовой смазкой (инертной для образца) на дно алюминиевой камеры(рисунок 3B). После помещения образцов в заполненную средой скважину над средой помещают мембрану, проницаемую для обмена_O2/CO2 и окружают галогенуглеродным маслом(рис. 3С).

Для рассечения рекомендуется использовать щипцы из нержавеющей стали с размером наконечника 0,05 х 0,02 мм и иглы диаметром 0,20 мм для разделения яриолов(рис. 4В,С). Мигрирующие ядра визуалируются на вращающийся диск конфокального инвертированного микроскопа CSU-X1, оснащенного камерой. Многопозиционные изображения были получены с помощью покадровой съемки каждые 15 минут при 24 °C. Интервал в 15 минут позволяет выполнять многопозиционные захваты с ограниченным фотоотбеливанием флуоресцентных белков и фототоксичностью для образцов. Кроме того, более короткий интервал не даст гораздо более информативных данных для отслеживания ядерных траекторий. Фильмы обрабатываются и анализируются с помощью программного обеспечения Fiji¹¹.

протокол

1. Подготовка среды визуализации

1. Приготовьте свежие средства в день использования. Пипетка 200 мкл среды Schneider (содержащая L-глютамин и 0,40 г/л NaHCO_3, дополненная 10% термоинактивированной сывороткой для телят плода, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
2. Добавка с 30 мкл инсулина 10 мг/мл.
3. Добавьте 4 мкл инактивированной теплом сыворотки для икр плода.

2. Подготовка камер наблюдения

1. Наконечником пипетки нанесите небольшое количество силиконовой смазки по всему отверстию на нижней стороне проколотого слайда(рисунок 4D).
2. Расположите крышку 24 x 50 мм толщиной 0,13-0,16 мм.
3. С помощью широкого конца наконечника пипетки надавите на крышку, чтобы сгладить силикон, чтобы запечатать крышку и создать силиконовое кольцо внутри слайда(рисунок 4F,G).

3. Рассечение яичники

1. Обезболить самку мухи нужного фенотипа на подушечке_CO2.
2. Перенесите самку в 150 мкл среды визуализации в рассекающий колодец(рисунок 4H).
3. Откройте одну самку, захватив ее грудную клетку щипцами и зажав дорсальную кутикулу брюшка второй парой щипцов.
4. Изолируйте и отсоедините пару яичников, которые должны быть хорошо видны при открытии кутикулы.
5. Осторожно удалите матку, яйцевод и мышечную оболочку(рисунок 4I).
6. Поместите каплю 10-15 мкл среды визуализации и перенесите один яичник в камеру визуализации(рисунок 4J,K).

4. Изоляция яичной камеры

1. Чтобы отделить яириоли, удерживайте задний конец яичники (к более старым стадиям) иглой. Раздразнить яриоли, осторожно потянув за гермарий другой иглой.
2. Удалить оставшуюся мышечную оболочку на яйцеклетках; одна игла удерживает оболочку, а другая тянет овариол через более крупные камеры (стадия 9 или старше).
3. Позвольте овариолу без обшивки опуститься и соприкоснуться с крышкой.
4. Удалите поздние стадии и остальные яичники из микрокамеры с помощью щипцов. Тщательно дистанцируйте овариолы от других с помощью игл, чтобы облегчить приобретение(рисунок 4L).

5. Закрытие камеры наблюдения

1. Вырежьте небольшой квадрат (10 х 10 мм) проницаемой мембраны(рисунок 4M,N).
2. Осторожно нанесите мембрану поверх среды визуализации, чтобы изгнать любые пузырьки воздуха(рисунок 4O).
3. Герметично запечатайте камеру тонким слоем галогенуглеродного масла вокруг скважины по контуру мембраны(рисунок 4P,Q).

6. Визуализация

1. Поместите настройку изображения на держатель слайдов перевернутого микроскопа с помощью 40-кратного объектива (HCX PL Apo, 1.25NA, масляное погружение).
2. Расположите и сохраните положения различных ооцитов стадии 6, в которых ядро готово к миграции.
3. Настройте лазеры 488 и 561 нм. При измеренной выходной мощности лазера 150 мВт используйте 30% мощности лазера и экспозицию 300 мс и 500 мс соответственно.
4. Настройте эксперимент. Берут промежуточную промежуточную съемку 12 ч с интервалом 15 мин-41 участок с интервалом 1 мкм, центрированный на ядре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии со временем экспозиции, описанным выше, эта настройка позволяет получить одну позицию примерно за 45 с. Поскольку происходит задержка из-за смены позиции, рекомендуется установить максимум 12 позиций в этих условиях.

7. Анализ изображений

1. Обрабатывайте фильмы на программном обеспечении Fiji, используя плагин Orthogonal view и вручную отслеживайте ядра.

Рисунок 4:Пошаговые снимки микрокамерного монтажа. (А,В,С) Подготовка необходимых инструментов: рассечение пластины скважины, щипцов, игл, сред для визуализации, кремниевой смазки, проницаемой мембраны, алюминиевой горки. (D) Нанесение силиконовой смазки на заднюю часть алюминиевого затвора с наконечником пипетки. (E) Стеклянная крышка наклеивается на силиконовую смазку для создания нижней части камеры. (Ф,Г) Нажимное нанесение на крышку с более широкой конечностью наконечника пипетки для создания соединения внутри камеры. (H,I) Рассечение яичников мух в средствах визуализации. (J)Пипетка капли среды визуализации в микрокамере. (К,Л) Отделение яриолов в микрокамере с помощью игл. (М,Н,О) Проницаемую мембрану разрезают на квадрат 10 х 10 мм и помещают поверх капли среды в микрокамеру. (П,В) Герметизация микрокамеры галогенуглеродным маслом. Образцы готовы к изображению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

До миграции ядро является динамичным и колеблется вокруг центрального положения в течение периода, определяемого как предмиграции. Эти небольшие движения отражают баланс толкающих и тянущих сил, которые поддерживают равновесие в середине ооцита. Количественно измещая траектории яде...

Обсуждение

Другие протоколы описывают, как подготовить и культивировать камеры яиц дрозофилы ex vivo для анализа живой визуализации^12,13. Новизна этого протокола заключается в использовании камеры визуализации, построенной с использованием полого алюминиевого с?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetize CO2 pad	Dutscher	789060	Anesthetize flies
Coverslip (24x50 mm)	Knittel Glass	VD12450Y100A	Observation-chamber preparation
Forceps Dumont #5	Carl Roth	K342.1	Dissection
Stainless steel needles	Entosphinx	20	Dissection
Heat-inactivated fetal calf serum	SIGMA-ALDRICH	F7524	Imaging medium
Insulin solution bovine pancreas	SIGMA-ALDRICH	10516 - 5ml	Imaging medium
Penicilin/Streptomycin solution	SIGMA-ALDRICH	P0781	Imaging medium
Permeable membrane	Leica	11521746	Observation-chamber preparation
Schneider Medium	Pan Biotech	P04-91500	Imaging medium
Silicon grease	BECKMAN COULTER	335148	Observation-chamber preparation
Spinning disk confocal	Zeiss	CSU-X1	Nuclear migration observation
Voltalef oil 10S	VWR	24627 - 188	Observation-chamber preparation