Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Эмбриональное развитие требует масштабной координации движения клеток. Двухфотонное возбуждение опосредованной лазерной абляцией позволяет осуществлять пространственно управляемую 3-мерную абляцию больших групп глубоких клеток. Кроме того, этот метод может исследовать реакцию коллективно мигрирующих клеток in vivo на возмущения в их механической среде.
Морфогенез включает в себя множество движений клеток для организации клеток в ткани и органы. Для правильного развития все эти движения должны быть тесно скоординированы, и накопленные данные свидетельствуют о том, что это достигается, по крайней мере частично, посредством механических взаимодействий. Тестирование этого на эмбрионе требует прямых физических возмущений. Лазерные абляции являются все более используемым вариантом, который позволяет снять механические ограничения или физически изолировать две клеточные популяции друг от друга. Тем не менее, многие абляции выполняются ультрафиолетовым (УФ) лазером, который предлагает ограниченное осевое разрешение и проникновение в ткани. Здесь описан способ абляции глубоких, значительных и пространственно четко определенных объемов с помощью двухфотонного микроскопа. Абляции демонстрируются в трансгенной линии рыбок данио, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок в осевой мезендодерме, и используются для разрыва осевой мезендодермы, не затрагивая вышележащую эктодерму или нижележащую желтковую клетку. Поведение клеток контролируется живой визуализацией до и после абляции. Протокол абляции может использоваться на разных стадиях развития, на любом типе клеток или тканей, в масштабах от нескольких микрон до более ста микрон.
Клеточно-клеточные взаимодействия играют жизненно важную роль в развитии. Клетки предоставляют сигналы, которые могут воспринимать их прямые соседи или клетки, находящиеся дальше, тем самым влияя на их судьбу и / или поведение. Многие из этих сигналов носят химический характер. Например, в хорошо охарактеризованных событиях индукции одна группа клеток производит диффузные молекулы, влияющие на судьбу другой клеточной популяции1. Другие сигналы, однако, являются механическими; клетки оказывают на соседей силы и ограничения, которые соседи воспринимают и на которые реагируют2.
Одним из способов изучения важности этих клеточно-клеточных взаимодействий in vivo является устранение некоторых клеток и наблюдение за последующим развитием. К сожалению, доступные методы удаления или уничтожения клеток ограничены. Клетки могут быть удалены хирургическим путем3,4 с помощью игл или небольших проводов, но такие методы лечения являются инвазивными, не очень точными и обычно выполняются под стереомикроскопом, предотвращая немедленную визуализацию под микроскопом. Кроме того, нацеливание на глубокие клетки подразумевает прокалывание отверстия в вышележащих тканях, создавая нежелательные возмущения. Генетически закодированные фотосенсибилизаторы, такие как KillerRed, использовались для индуцирования гибели клеток с помощью светового освещения5. Фотосенсибилизаторы представляют собой хромофоры, которые генерируют активные формы кислорода при световом облучении. Их основным ограничением является то, что они требуют длительного светового освещения (около 15 минут), чего может быть трудно достичь, если клетки движутся, и что они вызывают гибель клеток через апоптоз, который не является немедленным.
Наконец, лазерные абляции были разработаны и широко используются в последние 15 лет6,7,8,9,10,11,12. Лазерный луч фокусируется на целевой клетке/ткани. Он индуцирует его абляцию посредством нагревания, фотоабляции или плазменной абляции; задействованный процесс зависит от плотности мощности и времени экспозиции13. Большинство протоколов абляции используют УФ-лазеры для их высокой энергии. Однако ультрафиолетовый свет поглощается и рассеивается биологическими тканями. Таким образом, нацеливание на глубокие клетки требует высокой мощности лазера, который затем вызывает повреждения в более поверхностных, внеплановых тканях. Это ограничивает использование УФ-лазеров поверхностными структурами и объясняет их относительно низкое осевое разрешение. Нелинейная оптика (так называемая двухфотонная микроскопия) использует нелинейные свойства света для возбуждения флуорофора двумя фотонами примерно половинной энергии в инфракрасной области. При применении к абляциям это имеет три основных преимущества. Во-первых, инфракрасный свет меньше рассеивается и меньше поглощается биологическими тканями, чем ультрафиолетовый свет14, что позволяет достигать более глубоких структур без увеличения необходимой мощности лазера. Во-вторых, использование фемтосекундного импульсного лазера обеспечивает очень высокие плотности мощности, создавая абляцию за счет плазменной индукции, которая, в отличие от нагрева, не диффундирует пространственно15. В-третьих, плотность мощности, индуцирующая плазмообразование, достигается только в фокальной точке. Благодаря этим свойствам двухфотонная лазерная абляция может быть использована для точного нацеливания на глубокие клетки, не влияя на окружающую среду тканей.
Коллективные миграции являются отличным примером процессов развития, в которых взаимодействие клеток и клеток является фундаментальным. Коллективные миграции определяются как миграции клеток, в которых соседние клетки влияют на поведение одной клетки16. Природа этих взаимодействий (химических или механических) и то, как они влияют на миграцию клеток, может сильно различаться и часто не совсем понятна. Способность удалять клетки и наблюдать, как это влияет на других, имеет решающее значение для дальнейшего разгадывания этих коллективных процессов. Несколько лет назад мы установили — используя хирургические подходы — что миграция полстера во время гаструляции рыбок данио является коллективной миграцией17. Полстер представляет собой группу клеток, которые составляют первые интернализующие клетки на дорсальной стороне эмбриона18. Эти клетки, помеченные зеленым цветом в трансгенной линии Tg(gsc:GFP), расположены глубоко в эмбрионе, ниже нескольких слоев клеток эпибластов. Во время гаструляции эта группа возглавляет расширение осевой мезодермы, мигрируя от эмбрионального органайзера к полюсу животного19,20,21,22,23 (рисунок 1А). Мы установили, что клеткам требуется контакт со своими соседями, чтобы сориентировать свою миграцию в направлении полюса животных. Тем не менее, лучшее понимание клеточных и молекулярных основ этой коллективной миграции включает в себя удаление некоторых клеток, чтобы увидеть, как это влияет на оставшиеся. Поэтому мы разработали абляции больших и глубоких объемов с использованием двухфотонной микроскопической установки. Здесь мы демонстрируем использование этого протокола для разрыва полстера в его середине и наблюдаем последствия миграции клеток путем отслеживания ядер, помеченных Histone2B-mCherry.
Все работы с животными были одобрены Этическим комитетом N 59 и Министерством национального образования, высшего образования и исследований под номером APAFIS#15859-2018051710341011v3. Некоторые из шагов, описанных ниже, специфичны для нашего оборудования и программного обеспечения, но могут быть легко адаптированы к различному оборудованию.
1. Инъекционная подготовка
2. Подготовка эмбрионов
3. Подготовка двухфотонного микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются два лазера. Один из них используется для изображения GFP (при 920 нм) и выполнения абляций (при 820 нм). Он будет называться зеленым / абляционным лазером. Другой используется при 1160 нм для изображения mCherry. Он будет называться красным лазером.
4. Монтаж эмбриона
5. Определение местонахождения эмбриона и предабляционная визуализация
Рисунок 1: Успешный исход лазерной абляции. (А) Схема гаструлирующего эмбриона при 70% эпиболии в дорсальном виде; pAM: задняя осевая мезодерма; черная стрелка отмечает направление миграции полстеров; черный квадрат указывает на типичное поле зрения для абляций в полстере. (B) Схема крепления эмбриона для разрыва полстера. Боковой вид. Эмбрион смонтирован таким образом, что плоскость полстера перпендикулярна оптической оси. (C) выживаемость и (D) морфология контрольных и абляционных эмбрионов через 24 ч после оплодотворения. Шкала бара составляет 300 мкм. (E) Временная последовательность от лазерной абляции в полстере эмбриона Tg(gsc:GFP), экспрессирующего Histone2B-mCherry. Виды только с зеленым каналом являются максимальными проекциями. Крупный план отображает абляционную область, содержащую клеточный мусор. Виды с зеленым и красным (отображается как пурпурный) каналами представляют собой срезы XY и XZ до и после абляции (зеленая молния представляет абляцию). Срезы XZ показывают, что вышележащие ткани (пурпурные ядра без экспрессии GFP) не были затронуты абляцией нижележащих структур. Желтая пунктирная рамка соответствует ROI, выбранному для лазерной абляции. Шкала составляет 50 мкм на больших снимках и 25 мкм на крупном плане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
6. Определение местоположения цели и лазерная абляция
Глубина (мкм) | Лечебные каркасы |
-30 | 1 |
-35 | 1-2 |
-40 | 1-2 |
-45 | 2 |
-50 | 2-3 |
-55 | 3 |
-60 | 3-4 |
-65 | 4 |
-70 | 4 |
-75 | 4-5 |
-80 | 4-5 |
-85 | 5 |
-90 | 5 |
-95 | 5-6 |
-100 | 6 |
-105 | 6 |
Таблица 1: Предлагаемое количество рамок лазерной обработки в зависимости от глубины целевой клетки в эмбрионе (0 является поверхностью эмбриона).
7. Постабляционная верификация и визуализация
Рисунок 2: Отрицательные результаты лазерной абляции. (А) Типичные примеры потенциальных сбоев в лазерной абляции. Большие XY-виды - это максимальные проекции, вид XZ - реконструированный раздел. Обработанная лазером область расположена между двумя белыми наконечниками стрел. Три фокальные плоскости выделены в реконструированном разделе и отображены справа. Они соответствуют трем различным видам отказов. Плоскость 1 показывает, что клетки над полстером были удалены. Это можно определить по наличию автофлуоресцентного мусора на этой фокальной плоскости (см. крупный план) над полстером (см. положение плоскости 1 на реконструированном участке). Это, вероятно, является результатом неправильного определения региона, подлежащего удалению. Плоскость 2 показывает клетки, которые были отбелены, но не абляции. Они могут быть идентифицированы как сигнал низкой флуоресценции, все еще выявляющий неповрежденные контуры клеток (см. крупный план). Плоскость 3 отображает неповрежденные клетки, которые практически не отбеливались лазерной обработкой. Это может быть результатом неправильного определения региона, подлежащего удалению, или плохого обращения. В ситуациях, изображенных в плоскостях 2 и 3, возможно повторное применение абляционного лечения к неаблированным клеткам-мишеням. Шкала составляет 50 мкм на больших снимках и 20 мкм на крупных планах. (B) Типичный пример пузырьков (отмеченных белыми звездочками), образованных кавитацией из-за слишком интенсивной лазерной обработки. Такие пузырьки не ограничиваются Z-плоскостью, иногда даже охватывая всю высоту полстера, деформируя соседние ткани. Шкала составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
8. Анализ данных
Рисунок 3: Выделение передней половины полстера влияет на направленность клеток. (A) 3D-реконструкция эмбриона Tg(gsc:GFP), экспрессирующего Histone2B-mCherry (отображается в пурпурном цвете), до и после лазерной абляции, разрывающей полстер в его середине. Ядра, принадлежащие передней половине полстера, помечены пурпурной точкой и отслеживаются с течением времени до и после абляции (см. Фильм S1). Шкала шкалы составляет 50 мкм. (B) Как мера стойкости миграции, направление автокорреляции клеток, принадлежащих передней части полстера до и после абляции. Клетки демонстрируют непрерывное движение перед абляцией, которое резко уменьшается после абляции, что указывает на потерю коллективно-ориентированной миграции. Направленная автокорреляция также измерялась на клетках, образующих переднюю половину полстера неабляционного эмбриона, в качестве контроля. Конверты графика указывают на стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы разорвать полстер в его середине, эмбрион Tg(gsc: GFP), введенный с мРНК Histone2B-mCherry, был установлен на стадии 70% эпиболии, как описано на этапе 4. Полстер был идентифицирован экспрессией GFP, и эмбрион был смонтирован так, что плоскость полстера перпендикулярна оптической оси (
Здесь мы описываем протокол, который использует нелинейную оптику для выполнения глубоких и пространственно четко определенных объемных абляций. Наиболее важным шагом протокола является поиск условий лечения, которые обеспечивают достаточную энергию, чтобы позволить абляцию, но не ?...
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Мы благодарим Эмили Менант за уход за рыбами, Политехнический центр биовизуализации, в частности Пьера Маху, за помощь в создании живой визуализации на их оборудовании, частично поддерживаемом Région Ile-de-France (interDIM) и Национальным агентством исследований (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Эта работа была поддержана грантами ANR 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 и исследовательской и инновационной программой Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 840201, Министерства высшего и научного образования и Национального центра научных исследований.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
EOM driver | ConOptics | 302RM | |
Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены