JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описывается метод пробоподготовки, основанный на тепловой инактивации для сохранения эндогенных пептидов, избегающих деградации посмертно, с последующим относительным количественным определением с использованием изотопной маркировки плюс LC-MS.

Аннотация

Пептидомику можно определить как качественный и количественный анализ пептидов в биологическом образце. Его основные применения включают идентификацию пептидных биомаркеров заболевания или экологического стресса, идентификацию нейропептидов, гормонов и биологически активных внутриклеточных пептидов, обнаружение антимикробных и нутрицевтических пептидов из гидролизатов белка и могут быть использованы в исследованиях для понимания протеолитических процессов. Недавний прогресс в подготовке образцов, методах разделения, методах масс-спектрометрии и вычислительных инструментах, связанных с секвенированием белка, способствовал увеличению числа идентифицированных пептидов и характеризуемых пептидов. Пептидомические исследования часто анализируют пептиды, которые естественным образом генерируются в клетках. Здесь описан протокол пробоподготовки, основанный на термоинактивации, который исключает активность протеазы и экстракцию в мягких условиях, поэтому нет расщепления пептидных связей. Кроме того, показано относительное количественное определение пептидов с использованием метки стабильных изотопов путем восстановительного метилирования аминов. Этот метод маркировки имеет некоторые преимущества, поскольку реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими, химически стабильны и позволяют анализировать до пяти образцов за один прогон LC-MS.

Введение

«Омические» науки характеризуются глубоким анализом набора молекул, таких как ДНК, РНК, белки, пептиды, метаболиты и т.д. Эти крупномасштабные наборы данных (геномика, транскриптомика, протеомика, пептидомика, метаболомика и т. д.) произвели революцию в биологии и привели к продвинутому пониманию биологических процессов1. Термин пептидомика начал вводиться в начале 20 века, и некоторые авторы называли его ветвью протеомики2. Однако пептидомика имеет отличительные особенности, где основной интерес заключается в исследовании содержания естественно генерируемых пептидов в ходе клеточных процессов, а также характеристике биологической активности этих молекул3,4.

Первоначально исследования биологически активных пептидов были ограничены нейропептидами и гормональными пептидами через деградацию Эдмана и радиоиммуноанализ. Однако эти методики не позволяют провести глобальный анализ, в зависимости от выделения каждого пептида в высоких концентрациях, времени генерации антител, кроме возможности перекрестной реактивности5.

Анализ пептидомики стал возможен только после нескольких достижений в области жидкостной хроматографии, связанной с масс-спектрометрией (LC-MS) и проектами генома, которые предоставили комплексные пулы данных для исследований протеомики / пептидомики6,7. Кроме того, необходимо было установить специфический протокол экстракции пептидов для пептидов, потому что первые исследования, которые анализировали нейропептиды в глобальном масштабе в образцах мозга, показали, что на обнаружение влияет массивная деградация белков, которая происходит в основном в этой ткани через 1 мин после вскрытия. Присутствие этих пептидных фрагментов маскировало сигнал нейропептида и не представляло собой пептидом in vivo. Эта проблема решалась в основном применением быстрой нагревательной инактивации протеаз с помощью микроволнового облучения, что резко уменьшило присутствие этих фрагментов артефактов и позволило не только идентифицировать фрагменты нейропептидов, но и выявило наличие набора пептидов из цитозольных, митохондриальных и ядерных белков, отличающихся от деградома6,8,9.

Эти методологические процедуры позволили расширить пептидом за пределы известных нейропептидов, где сотни внутриклеточных пептидов, генерируемых главным образом действием протеасом, были идентифицированы в дрожжах10, рыбках данио11, тканях грызунов12 и клетках человека13. Было широко показано, что десятки этих внутриклеточных пептидов обладают как биологической, так и фармакологической активностью14,15. Кроме того, эти пептиды могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания и, возможно, имеют клиническое значение, как показано в спинномозговой жидкости у пациентов с внутричерепными мешковидными аневризмами16.

В настоящее время, помимо идентификации пептидных последовательностей, можно с помощью масс-спектрометрии получить данные абсолютного и относительного количественного определения. В абсолютном количественном определении уровни пептидов в биологическом образце сравниваются с синтетическими стандартами, в то время как в относительном количественном определении уровни пептидов сравниваются между двумя или более образцами17. Относительное количественное определение может быть выполнено с использованием следующих подходов: 1) «без меток»18; 2) метаболическая маркировка in vivo или 3) химическая маркировка. Последние два основаны на использовании стабильных изотопных форм, включенных в пептиды19,20. В анализе без меток уровни пептидов оцениваются с учетом силы сигнала (спектральных показателей) во время LC-MS18. Однако изотопная маркировка может получить более точные относительные уровни пептидов.

Во многих пептидомических исследованиях в качестве химической маркировки использовался триметиламмоний бутират (TMAB), а в последнее время было использовано восстановительное метилирование аминов (RMA) с дейтерированными и невейтерированными формами формальдегида и реагентов цианоборогидрида натрия11,21,22. Однако этикетки TMAB коммерчески недоступны, а процесс синтеза очень трудоемкий. С другой стороны, в RMA реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими этикетками, процедура проста в выполнении, а меченые пептиды стабильны23,24.

Использование RMA включает в себя формирование основания Шиффа, позволяя пептидам реагировать с формальдегидом с последующей реакцией восстановления через цианоборогидрид. Эта реакция вызывает диметилирование свободных аминогрупп на N-концевых и лизиновых боковых цепях и монометилатах N-концевых пролинов. Поскольку остатки пролина часто редки на N-конце, практически все пептиды со свободными аминами на N-конце помечены двумя метильными группами23,24,25.

протокол

Следующая процедура экстракции пептидов и восстановительного метилирования была адаптирована из ранее опубликованных процедур24,25,26,27. Этот протокол следовал руководящим принципам Национального совета по контролю за экспериментами на животных (CONCEA) и был одобрен Комиссией по этике использования животных (CEUA) в Институте бионауки Государственного университета Сан-Паулу. Шаги протокола показаны на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте все водные растворы в сверхчистой воде.

1. Экстракция пептидов

  1. Клеточная культура
    1. Культивируйте клетки SHSY5Y в 15-сантиметровой чашке при 37 °C при 5% CO2 в модифицированной среде Dulbecco Eagle's, содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина.
    2. Используйте 2-3 тарелки для каждого образца. Вырастите клетки до 100% слияния.
    3. После предполагаемого лечения промыть клетки дважды фосфатно-буферным физиологическим раствором. Затем добавьте 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора, соскоблите клетки и соберите в пробирку объемом 15 мл.
    4. Центрифугат при 800 х г в течение 5 мин и удаляют супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл ультраочищенной деионизированной воды при 80 °C.
    5. Перенесите содержимое трубки (клеточного лизата) в микрофьюжную трубку объемом 2 мл.
  2. Ткани животных (в основном нервные ткани):
    1. Обезболить самца дикого типа Danio rerio (рыбок данио ) смертельной дозой MS 222 (100 мг/л) и немедленно подвергнуть его 8 с микроволнового излучения для инактивации пептидазы и протеазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать микроволновую печь бытового типа. Микроволновая печь мощностью 900 Вт использовалась в течение 8-10 с на полной мощности. Используемая микроволновая печь должна быть в состоянии поднять температуру мозга до > 80 ° C в течение 10 с. Воспроизводимость при нагревании между образцами также будет достигнута при размещении ткани в том же месте в микроволновой печи.
    2. После термоинактивации соберите весь мозг в микрофьюжную трубку объемом 2 мл и заморозьте при −80 °C до анализа.
    3. Повторно суспендировать образец ткани в 1 мл ультраочищенной деионизированной воды при 80 °C. Обработайте ткань ультразвуком с помощью зонда, используя 30 импульсов (4 Гц) 1 с.
      ПРИМЕЧАНИЯ: Для тканей печени и почек используйте механический гомогенизатор при 10 000-30 000 об/мин в течение 20 с. Для мышечных тканей измельчите ткань в жидком азоте с помощью фарфорового тигля и пестика. Следующие этапы одинаковы для клеточного лизата или гомогенатной ткани.
  3. Инкубируют клеточный лизат или гомогенатную ткань при 80 °C в течение 20 мин. Далее охладите его на льду в течение 10-30 мин.
  4. Добавляют 10 мкл 1 М HCl запасного раствора на каждый 1 мл объема образца для получения конечной концентрации 10 мМ. Перемешать путем вихря в течение 20 с и далее инкубировать на льду в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подкислением убедитесь, что образец полностью охлажден, чтобы избежать разрыва пептидных связей, вызванных подкислением при повышенных температурах.
  5. Центрифугируют клеточный лизат или гомогенатную ткань при 12 000 х г при 4 °C в течение 15 мин. Соберите супернатант в низкосвязывающие белковые микроцентрифужные трубки и храните его при -80 °C.
  6. Очистите ультрафильтрационные устройства (отсечные фильтры 10 кДа), добавив воду и центрифугу при 2300 х г в течение 3 мин. Повторите этот шаг еще два раза.
  7. Поместите супернатант в предварительно промытые отсечные фильтры 10 кДа и центрифугу при 2 300 х г при 4 °C в течение 50 мин в центрифуге с рефрижераторной обработкой. Проточный представляет собой пептидный экстракт.
  8. Обессоливание образцов на колоннах очистки обратной фазы в соответствии с инструкциями завода-изготовителя с использованием растворов ацетонитрила (ACN) и трифторуксусной кислоты (TFA), как описано ниже:
    1. Уравновешивайте колонку 1 мл 100% ACN.
    2. Промыть колонну 1 мл раствором 5% ACN с 0,1% TFA.
    3. Загрузите весь объем образца в колонку.
    4. Промыть колонну 1 мл раствором 5% ACN с 0,1% TFA
    5. Элюируют пептиды из колонки раствором 1,8 мл 100% ACN с 0,15% TFA в белковых низкосвязывающих микроцентрифужных трубках.
  9. Полностью высушите образец в вакуумной центрифуге. Установить метод концентрации органических растворителей и температуру на уровне 30 °C. Время концентрации контролируется на дисплее.
    1. Храните образцы при температуре −80°C до следующего шага.

2. Количественная оценка пептидов флуорескамином

ПРИМЕЧАНИЕ: Количество пептида может быть оценено с использованием флуорескамина при рН 6,8, как описано ранее11,28. Этот способ заключается в присоединении молекулы флуорескамина к первичным аминам, присутствующим в остатках лизина (К) и/или N-конце пептидов. Реакцию проводят при рН 6,8, чтобы гарантировать, что флуорескамин реагирует только с аминогруппами пептидов, а не со свободными аминокислотами. Флуорескамин измеряется с помощью спектрофлуорометра на длине волны возбуждения 370 нм и длине волны излучения 480 нм.

  1. Получают различные концентрации стандартного пептида (0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,5 и 0,7 мкг/мкл) и хранят аликвоты при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пептид 5А (LTLRTKL) предлагается, поскольку он имеет известный состав и концентрацию.
  2. Готовят раствор флуорескамина (0,3 мг/мл) в ацетоне. Aliquot быстро в микроцентрифужных трубках (1 мл), герметизируется с помощью парапленки и хранится при -20 °C в темноте.
  3. Приготовьте 0,2 М фосфатного буфера (ПБ) при рН 6,8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 0,2 М ПБ, добавив 0,1 М фосфатного буфера pH 6,8 (26,85 мл Na2HPO3 1M) и 0,1 М фосфатного буфера pH 6,8 (23,15 мл NaH2PO3 1M) к 250 мл воды
  4. Повторное суспендирование пептидных образцов в 100-200 мкл ультраочищенной воды.
  5. Пипетка 2,5 мкл стандартных концентраций пептидов и образцов на белой 96-луночной пластине для флуоресцентных анализов в трех экземплярах. Добавьте 25 мкл 0,2 М фосфатного буфера.
  6. Добавьте 12,5 мкл флуорескамина с помощью многоканальной пипетки. Мягко гомогенизируйте в течение 1 мин на орбитальном вращательном шейкере.
  7. Затем добавьте 110 мкл воды с помощью многоканальной пипетки, чтобы остановить реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите раствор флуорескамина и сверхчистую воду в два резервуара, чтобы соединить эти растворы с помощью многоканальной пипетки.
  8. Отрегулируйте следующие параметры считывания на спектрофлуорометре: считывание образцов сверху, длина волны возбуждения при 370 нм и длина волны излучения при 480 нм.
  9. Считывание пластины на спектрофторометре.

3. Восстановительное метилирование маркировки аминов

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный изотопный метод маркировки основан на диметилировании аминных групп дейтерированными и недейтерированными формами формальдегидных и цианоборогидридных реагентов натрия. Конечный продукт этой реакции добавляет 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da или 36 Da к конечной массе каждого пептида в каждом доступном месте маркировки (лизин или N-терминал). Эта реакция производит разность m/z в пептидах, меченных различными формами, наблюдаемыми в спектре MS (таблица 1).

ВНИМАНИЕ: Для обработки этих соединений следует использовать надлежащее оборудование для обеспечения безопасности, и следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму воздействие. Процедуры с формальдегидными и цианоборогидридными реагентами натрия следует проводить в вытяжном шкафу, поскольку они очень токсичны (включая взвешивание цианоборогидрида натрия). Во время реакции закалки и подкисления может образовываться токсичный газ (цианистый водород).

  1. Приготовьте следующие свежие растворы из запаса или реагентов в день процедуры в сверхчистой воде:
    1. Разбавляют запас 37% формальдегида (CH2O) до 4%.
    2. Разбавляют запас 20% формальдегида дейтерированным (CD2O) до 4%.
    3. Разбавить запас 20 % дейтерированного формальдегида C13 (13CD2O) до 4%.
    4. Подготовьте 0,6 м NaBH3CN.
    5. Приготовьте 0,6 м NaBD3CN.
    6. Готовят раствор 1% бикарбоната аммония.
    7. Готовят раствор 5% муравьиной кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается относительного количественного определения пептидов, поскольку различные экспериментальные схемы могут быть выполнены в зависимости от количества используемых этикеток, во время процедуры химической маркировки необходимо внимание. Рекомендуется разделять небольшие аликвоты этикеток в отдельных стойках с соответствующими образцами, подлежащими маркировке, чтобы уменьшить вероятность человеческой ошибки при добавлении неправильного реагента в пробирки для образцов.
  2. Подготовьте каждый образец, содержащий до 25 мкг пептида. Образцы не должны содержать трис или бикарбонат аммония.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные ниже количества достаточны для каждого образца в объеме 100 мкл.
    Выполните шаги 3.3-3.8 в вытяжном шкафу.
  3. Добавьте к образцам 1/10-й объем 1 М TEAB (конечная концентрация раствора 100 мМ TEAB). Проверьте pH с помощью бумаги для индикатора pH; он должен быть в пределах 5-8. При необходимости настройте с помощью HCl или NaOH.
  4. Добавьте 4 мкл недейтерированного, дейтерированного формальдегида или C13 дейтерированного формальдегида в соответствии с установленной схемой маркировки. Перемешивать в течение 5 с путем вихря.
  5. Добавьте 4 мкл NaBH3CN (0,6 М) или NaBD3CN (0,6 М) в соответствии с установленной схемой маркировки. Перемешивать в течение 5 с путем вихря.
  6. Инкубировать в вытяжке в течение 2 ч при комнатной температуре, перемешивая каждые 30 мин.
  7. Повторите шаги 3.4 и 3.5. Инкубируйте образцы в вытяжке на ночь при комнатной температуре.
  8. Добавьте 16 мкл бикарбоната аммония (1%) и перемешайте путем вихря. Поместите образец на лед, добавьте 8 мкл муравьиной кислоты (5%) и перемешайте вихрем в течение 5 с.
  9. Объедините образцы, отрегулируйте рН до 2-4 и обессолите объединенные образцы на колоннах очистки с обратной фазой, как описано ранее в шаге 1.8.
  10. Полностью высушите образец в вакуумной центрифуге. Установить метод концентрации органических растворителей и температуру на уровне 30 °C. Время концентрации контролируется на дисплее.
  11. Храните образцы при температуре -20 °C.

4. Жидкостная хроматография и масс-спектрометрия

  1. Выполняйте анализ LC-MS с использованием системы nanoHPLC, соединенной с прибором MS, совместимым с метильными метками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные инструменты MS совместимы с маркировкой RMA. Система nanoHPLC, связанная с Orbitrap, обычно используется для выполнения анализа LC-MS через источник ионов наноэлектроспрея. Сначала образец загружается в преколонку, а пептиды разделяют в аналитической колонке. Элюирование пептидов проводят с использованием линейного градиента 5%-45% ацетонитрила, в 0,1% муравьиной кислоты, в течение 90 мин, с течением 200 нл/мин. Масс-спектрометр настроен на работу в режиме, зависящем от данных. Каждое полное сканирование приобретается при интенсивности 10-30 эВ, 2,3 кВ, а затем выбирают десять самых высоких пиков для фрагментации диссоциации, вызванной столкновением (CID). Время впрыска устанавливается на ионную ловушку в 100 мс, а инжекция преобразования Фурье (FT)-MS фиксируется с разрешением 1000 мс 30 000 при м/з 300-1800. Для выполнения сканирования фрагментации используется не менее 5000 отсчетов и динамическое исключение 70 с.

5. Относительное количественное определение пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Ms-спектры анализируются в программном обеспечении масс-спектрометра. Пиковые группы меченых пептидов с различными метками идентифицируются в спектрах МС. Относительное количественное определение рассчитывается по интенсивности каждого моноизотопного пика. Каждая обработанная группа сравнивается с соответствующей контрольной группой.

  1. Дважды щелкните правой кнопкой мыши необработанный образец файла, чтобы открыть программное обеспечение для анализа спектра. Загрузите хроматограммы времени времени удержания (RT) и спектра MS (EM) в две вкладки, верхнюю и нижнюю соответственно.
  2. Щелкните правой кнопкой мыши один раз последовательно на значках Параметры отображения и Массы на панели инструментов программного обеспечения и установите точность массы в четыре десятичных знака.
  3. Поместите курсор мыши в любом месте вкладки RT. Найдите время удержания соответствующего анализируемого иона и нажмите правую кнопку мыши. Ms спектр выбранного времени будет автоматически показан на вкладке EM.
  4. Поместите курсор мыши в любом месте вкладки EM. Ищите ионы, подлежащие анализу.
  5. Щелкните правой кнопкой мыши и удерживайте в соседней области слева рядом с этими ионами. Затем перетащите указатель мыши вправо в нужном диапазоне, чтобы увеличить интересующую область.
  6. Держите мышь расположенной на вкладке EM и нажимайте на стрелки правой или левой клавиатуры, чтобы определить диапазон ионов для анализа.
  7. Снова поместите курсор мыши на вкладку RT в начале нужного интервала времени.
  8. Щелкните правой кнопкой мыши и перетащите мышь до выбранного значения времени. Оставьте кнопку. Накопленная интенсивность ионов будет автоматически показана на вкладке ЭМ.
  9. Соберите данные об интенсивности m/z, z и ионов в электронной таблице.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Моноизотопная масса каждого пептида без добавления метильных групп рассчитывается по следующей формуле:

    Масса немодифицированного пептида = (m/z a x z) - (C a x T) - (1,008 x z)

    m/za     - наблюдаемая масса для заряда значения для моноизотопного пика для каждого пептида, помеченного различными комбинациями меток (a = 1, 2, 3, 4 или 5, соответствующий номеру образца).
    z — состояние заряда.
    Ca — моноизотопная масса пары метильных групп:
    Для a=1 Ca = 28,0313 (чистое добавление двух групп CH3 к первичному амину)
    Для a=2 Ca = 30,0439 для двух групп CHD2
    Для a=3 Ca = 32,0564 для двух групп CD2H
    Для a=4 Ca= 34,0690 для двух групп CD3
    Для a=5, Ca = 36,0757 для двух 13 групп CD3
    T - число пар метильных групп, включенных в пептид. Это можно вычислить по следующей формуле при использовании пяти тегов: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. Для пептидов, которые содержат один первичный амин и, следовательно, помечены только двумя метильными группами, присутствуют пиковые перекрытия на спектрах MS при использовании смежных меток. Пиковая интенсивность каждого меченого пептида может быть скорректирована с помощью уравнений, описанных Tashima и Fricker25.

6. Идентификация пептидов

  1. Для идентификации пептидов проанализируйте данные MS/MS с помощью поисковой системы базы данных29,30.
  2. Чтобы рассчитать коэффициент ложного обнаружения (FDR) с помощью метода слияния приманок, выполните поиск в базе данных приманок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используемые параметры поиска не являются специфичными для ферментов; допуск по массе предшественника установлен 15-50 ppm; допуск массы ионов фрагмента 0,5 Да; переменные модификации: реакционноспособные амины из остатков Lys и N-конца изотопных метилированных меток пептидов (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) и L5 (+36)), окисленный метионин (+15,99 Да) и ацетилирование (+42,01 Да).
  3. Затем отсортируйте пептиды по их средней локальной достоверности, чтобы выбрать лучшие спектры для аннотирования и отфильтровать их по FDR ≤5%.

figure-protocol-16759
Рисунок 1: Рабочий процесс пептидомических исследований. Этапы экстракции пептидов и восстановительного метилирования аминов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Результаты, полученные в результате запусков, проведенных на масс-спектрометре, хранятся в необработанных файлах данных, которые могут быть открыты в программном обеспечении масс-спектрометра. В спектрах MS можно наблюдать пиковые группы, представляющие меченые пептиды по используемо...

Обсуждение

В большинстве исследований пептидомики одним из критических этапов, без сомнения, является пробоподготовка, которую следует тщательно выполнять, чтобы избежать присутствия пептидных фрагментов, генерируемых протеазами через несколько минут после вскрытия. Первоначальные исследова?...

Раскрытие информации

Конкурирующих финансовых интересов не существует.

Благодарности

Разработка и использование методов, описанных здесь, были поддержаны грантом Бразильского национального исследовательского совета 420811/2018-4 (LMC); Гранты Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) и 21/01286-1 (MEME). Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке статьи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 kDa cut-off filtersMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa
AcetoneSigma-Aldrich179124
AcetonitrileSigma-Aldrich1000291000
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich11213
analytical column (EASY-Column)EASY-Column(SC200) 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonateSigma-AldrichE10521MS-222
FluorescamineSigma-AldrichF9015
Formaldehyde solutionSigma-Aldrich252549
Formaldehyde-13C, d2, solutionSigma-Aldrich596388
Formaldehyde-d2 solutionSigma-Aldrich492620
Formic acidSigma-Aldrich33015
Fume hoodQuimisQ216
Hydrochloric acid - HClSigma-Aldrich258148
LoBind-Protein retention tubesEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificLTQ Velos
Microwave ovenPanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.VERSION 8.5
Phosphate-buffered salineInvitrogen3002tablets
precolumn (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1
Refrigerated centrifugeHermleZ326Kfor conical tubes
Refrigerated centrifugeVisionVS15000CFNIIfor microtubes
Reversed-phase cleanup columns   (Oasis HLB 1 cc Cartridge)Waters186000383Oasis HLB 1 cc Cartridge
Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
Sodium cyanoborohydride - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
Sodium phosphate dibasicSigma-AldrichS9763NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
Standard peptideProteimaxamino acid sequence: LTLRTKL
Triethylammonium buffer - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
Trifluoroacetic acid - TFASigma-AldrichT6508
Ultra purified waterMilli-QDirect-Q 3UV
Vacuum centrifugeGeneVacMiVac DNA concentrator
Water bathCientec266
Xcalibur SoftwareThermoFisher ScientificOPTON-30965

Ссылки

  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
  4. Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
  5. Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
  6. Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
  7. Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
  8. Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
  9. Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
  10. Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
  11. Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
  12. Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
  13. Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
  14. De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
  15. Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
  16. Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
  17. Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
  18. Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
  19. Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
  20. Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
  21. Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
  22. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  23. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  24. Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
  25. Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
  26. Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
  27. Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
  28. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
  29. Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
  30. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
  31. Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
  32. Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
  33. Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
  34. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены