Хирургический подход, проблемы и решения трансплантации матки у крыс

Резюме

В настоящем протоколе описаны все основные этапы успешной трансплантации матки (UTx) у крыс. Модель крысы оказалась подходящей для содействия клиническому внедрению UTx; однако UTx крыс - очень сложная процедура, требующая тщательных инструкций.

Аннотация

Трансплантация матки (UTx) - это новый подход к лечению женщин с абсолютным маточным фактором бесплодия (AUFI). По оценкам, 3-5% женщин страдают от AUFI. Эти женщины были лишены возможности иметь детей до появления UTx. Клиническое применение UTx было обусловлено экспериментальными исследованиями на животных, и первый успешный UTx был достигнут на крысах. Учитывая их физиологические, иммунологические, генетические и репродуктивные характеристики, крысы являются подходящей модельной системой для таких трансплантатов. В частности, их короткий срок беременности является явным преимуществом, так как обычной конечной точкой экспериментального UTx является успешная беременность с живорождением. Самой большой проблемой для моделей крыс остается маленькая анатомия, которая требует передовых микрохирургических навыков и опыта. Несмотря на то, что UTx привела к беременности в клинике, процедура не установлена и требует постоянной экспериментальной оптимизации. Здесь представлен подробный протокол, включающий основные способы устранения неполадок при UTx крыс, что, как ожидается, облегчит понимание всей процедуры для тех, кто не имеет опыта в этом типе микрохирургии.

Введение

Трансплантация матки (UTx) является новым методом лечения абсолютного бесплодия по маточному фактору (AUFI). AUFI возникает в результате отсутствия (врожденного или приобретенного) или порока развития матки и поражает 3-5% женщин во всем мире¹. Этические, юридические или религиозные причины исключают усыновление или суррогатное материнство для многих женщин, которые хотят материнства, но страдают от AUFI². Для этих женщин UTx остается единственным вариантом создать собственную семью. UTx применялся в клинике, хотя и с переменным успехом; Процедура технически сложна и требует постоянного совершенствования для ее клинического становления.

В 2014 году первая трансплантация матки от живого донора (LD), приведшая к успешной беременности, была выполнена новаторской шведской группой Brännström³. Первые роды после UTx от умершего донора (DD) были зарегистрированы в 2016 году в Бразилии⁴. К 2021 году во всем мире было выполнено более 80 UTx, однако с вероятностью успеха около 50% и с трансплантатами, поступающими из LD для большинства¹.

Несмотря на то, что UTx не спасает жизнь, он становится все более популярной процедурой для удовлетворения желаний собственного потомства. Таким образом, спрос на трансплантаты растет, что ставит донорство DD в центр внимания в будущем. Однако донорство DD осложняется значительно более длительным холодным (а в случае сердечной смерти также теплым) ишемическим воздействием, повышающим риск дисфункции трансплантата и отторжения ^5,6. Хирургическая техника, требующая соответствия совместимости и связанная с ней иммуносупрессия остаются критическими проблемами в отношении исходов UTx⁷.

Для управления вышеуказанными рисками в клинике необходимы соответствующие модели на животных для исследования ишемии и иммуносупрессии. Наиболее клинически значимой конечной точкой для животных моделей остаются успешные роды; на сегодняшний день беременность после экспериментального UTx была достигнута у мышей, крыс, овец, кроликов и обезьян^{Cynomolgus 8}. В то время как более крупные животные предназначены для приобретения и оптимизации хирургических методов, грызуны имеют явное преимущество в виде коротких периодов беременности. Таким образом, модели грызунов превосходят их по практическим, финансовым и этическим соображениям⁹. Тем не менее, основной проблемой UTx у мышей является маленькая анатомия, при этом очень сложная операция связана с низкой воспроизводимостью мышиного UTx¹⁰. Напротив, крысы хирургически более доступны и сохраняют преимущества коротких сроков беременности. Таким образом, крыса стала моделью выбора для UTx⁹. Wranning et al. представили крысиную модель ортотопического UTx в 2008 году, и с использованием этой модели сообщалось о первых живорождениях после UTx и естественного спаривания^11,12,13. Последующие исследования внесли решающий вклад в реализацию UTx у людей⁹.

Тем не менее, UTx остается сложной задачей у крыс, и только несколько групп до сих пор освоили эту хирургическую технику. Одним из существенных препятствий для распространения UTx крыс среди исследователей является отсутствие точного описания отдельных микрохирургических этапов, подводных камней и соответствующих мер по устранению неполадок¹⁴. Этот протокол направлен на то, чтобы предоставить подробное руководство по этой очень сложной микрохирургической процедуре, чтобы облегчить внедрение этой модели животных в будущие исследования.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Федеральными правилами Швейцарии по животным и одобрены Ветеринарным управлением Цюриха (No 225/2019), обеспечивая заботу о человеке. Самки девственных крыс Льюиса (масса тела 170-200 г) и самки девственных коричневых норвежских крыс (170-200 г) использовались в качестве доноров/реципиентов матки, в то время как самцы крыс Льюиса (300-320 г) использовались для спаривания. Крысы были в возрасте от 12 до 15 месяцев. Животные были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержались в контролируемых условиях и обогащенной среде со свободным доступом к воде и стандартному корму.

1. Извлечение матки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре, пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованными отчетами^12,13,15.

1. Индуцируют анестезию изофлураном и кислородом в закрытом контейнере из оргстекла (14 см x 25 см x 13 см) в течение 1-2 мин (5 об.% изофлурана в O₂).
   1. Вводят бупренорфин подкожно (0,05 мг/кг) и бупивакаин (0,5%, 8 мг/кг) подкожно в область планируемого разреза брюшной полости за 30 мин до операции.
   2. Сбрейте всю кожу живота крысы электробритвой.
   3. Используйте ленты, чтобы держать животное на нагревательной пластине во время операции. Нанесите глазную мазь на оба глаза.
   4. Поддерживайте анестезию во время процедуры 2-4% изофлурана в кислороде путем непрерывного введения через небольшой носовой конус.
   5. Контролируйте глубину анестезии по клиническим параметрам без специальных инструментов (частота дыхания ~ 70-120 / мин - допустимо медленное снижение скорости на 50% во время анестезии; проверка глубины анестезии с помощью защемления пальцев ног; цвет слизистых оболочек должен быть розовым, а не синим или серым)¹⁶, и соответствующим образом отрегулируйте концентрацию изофлурана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно: частый мониторинг дыхания во время операции возможен с помощью ассистента.
   6. Подтвердите глубину анестезии, выполнив защемление пальца ноги.
   7. Очистите кожу живота круговыми движениями тремя чередующимися тампонами антисептического раствора и 70% спирта. Дайте высохнуть.
   8. Над животным наложите стерильную драпировку (см. Таблицу материалов) с брюшным окном.
2. Выполните срединную лапаротомию.
   1. Вскрывают брюшную полость через разрез длиной 6-8 см, начиная с 0,5 см ниже мечегрудины по направлению к гипогастрию. Используйте скальпель No 10 для разреза кожи и маленькие острые ножницы для разреза белой линии. Не повреждайте печень или мочевой пузырь.
   2. Переместите кишечник за пределы брюшной полости с помощью ватных тампонов, аккуратно накройте их марлей, смоченной стерильным физиологическим раствором, и защитите стерильным полиэтиленовым пакетом для лучшей изоляции.
   3. Вставьте ретракторы или зажимы (см. Таблицу материалов) в левую и правую папки брюшной стенки, чтобы держать брюшную мышцу в стороне, а брюшную полость открытой, чтобы обеспечить оптимальный доступ и видимость матки и связанных с ней сосудов. Закрепите зажимы/втягивающие устройства лентами.
   4. Нанесите предварительно подогретый физиологический раствор, чтобы сохранить операционную область и кишечник влажными и избежать высыхания внутренних органов.
3. Заготавливают правый рог матки с общей маточной полостью и шейкой матки плюс сосудистые ножки, включая правые маточные, внутренние и общие подвздошные сосуды.
   1. Лигат (полиглактин 4/0; см. Таблицу материалов), прижигают и отделяют левый рог матки, прилегающий к разветвлению, от общей полости матки.
   2. Удалите лишний жир, окружающий матку и влагалище.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите жир вокруг сосудистой системы матки.
   3. Рассекают мочевой пузырь в месте его прикрепления к шейке матки с прижиганием всех дренирующих и питающих сосудов мочевого пузыря. Во время прижигания поддерживайте достаточное расстояние между шейкой матки и влагалищем, чтобы избежать ненужного прижигания этих двух структур. В противном случае повышается риск некроза трансплантата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство хирургических манипуляций должны воздействовать на мочевой пузырь. Втяните или потяните мочевой пузырь каудально с помощью сосудистого зажима (см. Таблицу материалов), чтобы получить лучший обзор excavatio vesicouterina.
   4. Прижигают и разрывают нисходящие маточные сосуды на уровне мочеточника как можно дальше шейки матки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте микроциркуляцию вокруг влагалища и шейки матки как можно больше во время деления.
   5. Отделите шейную/вагинальную часть будущего трансплантата от крепления прямой кишки и паравагинальной и парацервикальной связок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прижигания влагалища трансплантата.
   6. Осторожно рассеките влагалище с помощью диатермии на расстоянии около 2-3 мм от шейки матки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ворсинки (шейка матки) не видны внутри просвета влагалища.
   7. Найдите как маточную артерию, так и вену в их истоках. Лигат (полиамид 8/0; см. Таблицу материалов) прижигает и разрывает ягодичные сосуды и все сосуды каудально маточных сосудов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно возможна прямая перевязка общей подвздошной вены каудально с полой матки.
   8. Путем тупого рассечения освобождают общие подвздошные сосуды друг от друга, от раздвоения аорты и полой вены вплоть до деления маточных сосудов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно получить лучший хирургический доступ к области, удалив один или два соседних лимфатических узла.
   9. Иссекают правый рог матки на 3 мм от маточной трубы, предварительно прижигая маточно-яичниковую ножку на том же уровне. Это позволяет анастомозировать рог матки трансплантата в верхнюю часть рога матки реципиента.
   10. Установите лигатуры (полиамид 8/0) непосредственно вокруг правой общей подвздошной артерии и вены, проксимальнее бифуркации аорты и полой кишки. Сделать небольшой разрез (0,5-1 мм) в правой общей подвздошной артерии, прилегающей к бифуркации, и ввести в просвет согнутую, затупленную иглу 30 G или прямую затупленную иглу 25 G (для промывания). Закрепите его лигатурой (полиамид 6/0).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Еще одним вариантом является дополнительное крепление бульдожьим зажимом, чтобы избежать смещения иглы и/или сосуда.
   11. Рассеките общую подвздошную вену каудально лигатуры в правой общей подвздошной вене, чтобы обеспечить отток во время промывки.
4. Промойте трансплантат, выполнив следующие действия.
   1. Промывание матки вручную с помощью шприцев объемом 3 мл с примерно 9 мл холодного раствора Рингера (RHX: Ringer с добавлением 50 МЕ / мл гепарина и 0,4 мг / мл ксилазина) при скорости потока 6 мл / мин. Снова промойте 6 мл раствора для сохранения органов с добавлением гепарина (50 МЕ / мл) и ксилазина (0,4 мг / мл) (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте высокого давления промывки и обеспечьте правильное размещение иглы.
   2. Удаляют трансплантат, когда ткани матки побледнеют. Разрезают общую подвздошную артерию каудально лигатуры при бифуркации брюшной аорты.
5. Поместите трансплантат в охлажденный раствор для сохранения органов (4 °C) для подготовки и хранения на заднем столе перед трансплантацией.
6. После удаления трансплантата усыпьте животное, сначала увеличив настройку изофлурана до максимума, а затем индуцируя двусторонний пневмоторакс с последующим обескровливанием¹⁷.

2. Сингенная трансплантация матки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре, пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованными отчетами^12,13,15.

1. Индуцируйте анестезию и подготовьте животное, как указано в шаге 1.1.
   1. За 30 мин до операции вводят эффективную анальгезию (как описано на этапе 1.1.1) и высокомолекулярный гепарин 200 МЕ/кг.
2. Выполните срединную лапаротомию.
   1. Вскрывают брюшную полость через разрез по средней линии длиной 6-8 см, начиная с 0,5 см ниже мечегрудицы по направлению к гипогастрию. Используйте скальпель No 10 для разреза кожи и маленькие острые ножницы для разреза белой линии. Не повреждайте печень и мочевой пузырь.
   2. Переместите тонкие кишки за пределы брюшной полости с помощью ватных тампонов, оберните их стерильной влажной марлей и накройте стерильным полиэтиленовым пакетом для лучшей изоляции.
   3. Вставьте ретракторы или зажимы в левую и правую папки брюшной стенки, чтобы держать перитонеальную мышцу в стороне, а брюшную полость открытой, чтобы обеспечить оптимальный доступ и видимость матки и связанных с ней сосудов. Закрепите зажимы/втягивающие устройства лентами.
   4. Нанесите предварительно подогретый физиологический раствор, чтобы сохранить операционную область и кишечник влажными и избежать высыхания внутренних органов.
3. Выполняют гистерэктомию с рассечением и мобилизацией верхней трети влагалища из прямой кишки и мочевого пузыря.
   1. Прижигайте микроциркуляторное русло вокруг матки, шейки матки и влагалища. Разрежьте и отделите матку от окружающих структур близко к органу, чтобы защитить зловещую микроциркуляцию матки.
   2. Удалите жировую ткань из окружающей среды.
   3. Ампутируют левый рог путем прижигания. С правой стороны сохраняют 7-8 мм сегмент верхней части матки для последующего анастомоза к маточному трансплантату.
4. Провести пересадку матки.
   1. Мобилизуйте и разделите правые общие подвздошные сосуды, от начала маточных сосудов до бифуркации аорты / половой кишки.
   2. Расположите трансплантат в брюшной полости. Заверните трансплантат в марлю, смоченную в холодном органосохраняющем растворе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантат должен храниться в холоде во время анастомоза.
   3. Установите атравматичные сосудистые зажимы на правую общую подвздошную вену с каждой стороны, обрамляя будущее место анастомоза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Понизьте анестезию до 1-1,5 об.% изофлурана, чтобы адаптироваться к внезапному снижению предварительной нагрузки на сердце и возникающей в результате гипотензии.
   4. Разрезают щель размером чуть больше, чем отверстие трансплантатной вены в общую подвздошную вену.
   5. Расположите вену трансплантата.
   6. Наложите по одному шву (полиамид 10/0; см. Таблицу материалов) в каждый угол щели на правой общей подвздошной вене.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите шовный узел в каудальном углу свободным для лучшей регулировки и предотвращения эффекта кисетной шнурки.
   7. Регулярно промывайте область анастомоза охлажденным RHX во время процедуры, чтобы предотвратить тромбозы.
   8. Анастомозируйте одну сторону вены трансплантата к вене реципиента с помощью шести-восьми петель непрерывного шва (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с черепного шва (полиамид 10/0) и сначала анастомозируйте входящую часть сосудов.
   9. Таким же образом анастомозируйте другую сторону сосуда, на этот раз начиная с внешней стороны.
   10. Завяжите узел на краниальном шве, а затем один на каудальном шве (полиамид 10/0) после завершения анастомозов с обеих сторон.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Затягивайте непрерывные швы ровно настолько, насколько это необходимо, чтобы предотвратить эффект кисетной шнурки.
   11. Установите атравматичные сосудистые зажимы на правую общую подвздошную артерию с каждой стороны, обрамляя место будущего анастомоза.
   12. Выполнить артериальный анастомоз (правая общая подвздошная артерия [RCIA] через 8-10 петель с использованием прерывистых швов (полиамид 10/0).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Прерывистые швы легче контролировать, чем непрерывные (опционально с техникой «рыбий рот»)¹⁸. Постоянное промывание области анастомоза охлажденным RHX во время процедуры способствует предотвращению тромбозов. При использовании сплошных швов выполняют этот этап аналогично венозному анастомозу.
5. Выполните реперфузию трансплантата.
   1. Когда оба участка анастомоза окажутся открытыми и кровотечение остановится, отпустите сосудистые зажимы на сосудах трансплантата (рис. 2).
   2. Осмотрите трансплантат на наличие признаков реперфузии, таких как покраснение, заполнение вены или пульсация в артерии трансплантата.
   3. Соедините вагинальную манжету трансплантата со сводом влагалища реципиента с помощью шести-семи внутрипросветных (6/0 полиглактина) прерванных швов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с одного шва в положении «12 часов», а затем наложите следующие швы в положениях «10 часов» и «1 час». Два шва в положениях «9 часов» и «3 часа» должны быть завязаны после швов в первом ряду^19,20.
   4. Анастомозируйте рог матки трансплантата встык к оставшемуся черепному сегменту матки-реципиента с помощью пяти-семи прерывистых швов (полиамид 7/0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прошивайте просвет.
6. Закройте живот сплошным швом. Используйте полиглактин 4/0 для наложения швов на мышечный слой и полиамидные или хирургические зажимы для раны 6/0 для кожи.
7. Дайте животному восстановиться в прогретой клетке после завершения пересадки. Оставайтесь с животным до тех пор, пока оно не восстановит способность лежа на грудине, и поддерживайте одиночное жилье до его полного выздоровления. Обеспечьте лечение псоопертаивной анальгезией путем подкожного введения бупренорфина (0,05 мг / кг) и подходящего НПВП, но не ранее чем через 4-8 часов после первой дозы анестезии. Обеспечьте непрерывный прием бупренорфина через питьевую воду (1 мг / кг, перорально, 5 мл бупренорфина в 160 мл питьевой воды (0,3 мг / мл)) в течение трех дней после операции.
8. Кожный шов снимают через 10-14 дней после операции.

Результаты

Представлены результаты двух групп крыс. UTx проводился до (группа 1, n = 8) и после (группа 2, n = 8) корректировки протокола (таблица 1), чтобы продемонстрировать эффекты наших модификаций (см. Обсуждение для объяснения наших модификаций)^12,15,21

Обсуждение

Представленный здесь протокол предлагает подробные инструкции по хирургическому подходу к трансплантации матки у крыс. Протокол был оптимизирован для увеличения шансов живорождения после UTx и последующего спаривания. Оригинальный протокол был заимствован у группы Brännström 12,13, вдохно?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angled to Side Scissor 5 mm	F.S.T	15008-08
Big Paper Clip	No specific		Used as retractor
Blunt Bend Needle G30	Unimed S.A.
Bupivacain 0.5%	Sintetica
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Temgesic
Dosiernadel G25	H.SIGRIST& PARTNER AG
Dumont #5SF Forceps	F.S.T	11252-00
Ethilon 10/0	Ethicon	2810G
Ethilon 6/0	Ethicon	667H
Ethilon 7/0	Ethicon	EH7446H
Ethilon 8/0	Ethicon	2808G
Femal Brown Norway Rats (150-170 g)	Janvier
Femal Lewis Rats (150-170 g)	Charles River Deutschland
Fine Scissors - Sharp	F.S.T	14060-09	Any other small scissor works too
Halsey Micro Needle Holder	F.S.T	12500-12	Any other small needholder works too
Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL	B. Braun
Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL)	Institute Georges Lopez		Organ preservation solution
Male Lewis Rats (300-320 g)	Charles River Deutschland
Micro Serrefines 13 mm	F.S.T	18055-04
Micro Serrefines 16 mm gebogen	F.S.T	18055-06
Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock	F.S.T	18056-14
Mölnlyncke Op Towel	Mölnlyncke	800300	Sterile drape
NaCl 0.9%	B.Braun
Octenisept	Schülke
Paper Tape	Tesa		For fixing the animal
Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02	Philips	12824216
Ringerfundin	B.Braun
Rompun 2%	Bayer		Xylazine
Round Handled Needle Holders	F.S.T	12075-12
Round Handled Needle Holders	F.S.T	12075-12
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45°	F.S.T	00276-13
Sacryl Naht	KRUUSE	152575
Scapel No 10	Swann Morton	201
Small Histo-Container			Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft
Small Plastik Bags			Any transparant plastic bags are fine
Steril Cotton swab	Lohmann-Rauscher		Any steril cotton swab is fine
Sterile Gauze	Lohmann-Rauscher		Any steril gauze is fine
Straight Scissor 8mm	F.S.T	15024-10
Surgical microscope – SZX9	Olympus	OLY-SZX9-B
Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm	Sutter	78 01 69 SLS
Suture Tying Forceps	F.S.T	00272-13
ThermoLux warming mat	ThermoLux
Tissue Forceps for Skin			Any tissue forceps are fine
Vesseldilatator Forceps	F.S.T	00125-11
Vicryl  plus 4/0	Ethicon	VCP292H