JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье мы описываем комплексный метод измерения митохондриального окислительного фосфорилирования в свежих пермеабилизированных скелетных мышечных волокнах из мышц человека или мыши. Этот метод позволяет количественно оценивать митохондриальное дыхание в режиме реального времени и оценивать топливные предпочтения и метаболическую гибкость при сохранении существующих митохондриальных сетей и целостности мембран.

Аннотация

Митохондриальная функция, краеугольный камень производства клеточной энергии, имеет решающее значение для поддержания метаболического гомеостаза. Его дисфункция в скелетных мышцах связана с распространенными метаболическими нарушениями (например, диабетом и ожирением), мышечными дистрофиями и саркопенией. Несмотря на то, что существует множество методов оценки содержания и морфологии митохондрий, отличительным методом оценки функции митохондрий является измерение митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS) с помощью респирометрии. Количественное определение митохондриального OXPHOS дает представление об эффективности производства митохондриальной окислительной энергии и клеточной биоэнергетики. Репирометр с высоким разрешением обеспечивает высокочувствительные и надежные измерения митохондриального OXPHOS в пермеабилизированных мышечных волокнах путем измерения изменений скорости потребления кислорода митохондриями в режиме реального времени. Использование пермеабилизированных мышечных волокон, в отличие от изолированных митохондрий, сохраняет митохондриальные сети, поддерживает целостность митохондриальных мембран и, в конечном итоге, позволяет проводить более физиологически значимые измерения. Эта система также позволяет измерять топливные предпочтения и метаболическую гибкость - динамические аспекты энергетического метаболизма мышц. В этой статье мы предоставляем исчерпывающее руководство по измерению митохондриального OXPHOS в скелетных мышечных волокнах человека и мыши с использованием респирометра высокого разрешения. Группы скелетных мышц состоят из различных типов волокон, которые различаются по предпочтению митохондриального топлива и биоэнергетике. Используя респирометр с высоким разрешением, мы описываем методы оценки как аэробных гликолитических субстратов, так и субстратов жирных кислот для оценки топливных предпочтений и метаболической гибкости в зависимости от типа волокна. Протокол универсален и применим как к мышечным волокнам человека, так и к мышечным волокнам грызунов. Цель состоит в том, чтобы повысить воспроизводимость и точность оценок митохондриальной функции, что улучшит наше понимание органеллы, важной для здоровья мышц.

Введение

Митохондрии являются краеугольным камнем производства клеточной энергии, что делает их незаменимыми для поддержания оптимального клеточного и организменного гомеостаза. Эти двухмембранные органеллы в первую очередь отвечают за окислительное фосфорилирование. Этот процесс эффективно преобразует питательные вещества, такие как сахара и жирные кислоты, в аденозинтрифосфат (АТФ), клеточную валюту для получения энергии. Помимо своей роли в энергетическом обмене, митохондрии также являются ключевыми регуляторами различных клеточных процессов, включая апоптоз, гомеостаз кальция и активные формы кислорода (АФК)1,2. Из-за их ключевой роли в поддержании клеточного и организменного гомеостаза нарушения в функции митохондрий часто оказывают пагубное воздействие на здоровье тканей и организма. В скелетных мышцах митохондриальная дисфункция связана с многочисленными болезненными состояниями, включая метаболические нарушения (например, ожирение, диабет и сердечно-сосудистые заболевания), саркопению и мышечную дистрофию 3,4,5,6,7,8.

Митохондриальная дисфункция может проявляться в первую очередь в виде изменения митохондриального состава, количества и морфологии, а также нарушения метаболизма. Таким образом, достижение всестороннего понимания митохондриальной дисфункции требует интегративного и целостного подхода. Первоначальные исследования по определению характеристик включают изучение уровней экспрессии белковых комплексов дыхательной цепи в качестве показателя митохондриального содержимого, количественную оценку митохондриальной ДНК и маркеров биогенеза в качестве меры митохондриального биогенеза, а также сложную электронную микроскопическую визуализацию для оценки морфологии митохондрий 9,10. Дополнительная оценка митохондриальной функции включает оценку продукции клеточных АФК и АТФ и потенциала митохондриальных мембран9.

Поскольку митохондрии играют важную роль в производстве клеточной энергии и гомеостазе, отличительным признаком для оценки функции митохондрий является измерение митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Респирометрия с высоким разрешением пермеабилизированных мышечных волокон позволяет измерять изменения скорости потребления кислорода митохондриями в режиме реального времени в качестве индикатора динамических изменений активности дыхательной цепи митохондриального OXPHOS 9,11,12. Применение селективных химических модуляторов и ингибиторов позволяет измерять активность различных дыхательных комплексов непосредственно и последовательно. Хотя изолированные митохондрии могут быть использованы в респирометрии, использование свежих, пермеабилизированных мышечных волокон поддерживает эндогенные митохондриальные сети и целостность мембран, что позволяет проводить более физиологически значимые измерения. Кроме того, поскольку разные типы мышечных волокон имеют разные предпочтения в отношении субстрата и скорость дыхания, эта система позволяет измерять изменения в топливных предпочтениях и метаболической гибкости на основе типа волокон13.

В данной статье мы описываем комплексный протокол измерения митохондриального OXPHOS с использованием скелетных мышечных волокон человека или мыши в респирометрической системе с высоким разрешением. Включены методы количественной оценки митохондриального кислородного дыхания в окислительных или гликолитических волокнах с использованием пирувата или пальмитоилкарнитина в качестве субстрата. Этот протокол позволяет использовать другие топливные субстраты для решения конкретных метаболических вопросов, связанных с дефектами использования субстрата и предпочтением топлива.

протокол

Все процедуры на мышах были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Вашингтонского университета. Для этих экспериментов могут быть использованы мыши любого пола, возраста и веса, и это будет зависеть от характера экспериментального вопроса, который мы хотим решить. Здесь используются взрослые мыши (в возрасте 12-16 недель), самцы мышей дикого типа C57BL/6. Все человеческие процедуры были одобрены Институциональным наблюдательным советом Вашингтонского университета. Субъекты исследования дали согласие на использование данных, а репрезентативные данные о человеке, включенные в настоящий протокол, взяты из опубликованного исследования14. Данные здесь получены от женщин без диабета в постменопаузе (55-75 лет). Подробная информация о приготовлении реактивов, необходимых для проведения анализа, представлена в таблице 1. Информация о конкретных реагентах, инструментах и машинах, используемых в анализе, приведена в Таблице материалов. Схематический обзор протокола представлен на рисунке 1.

figure-protocol-1235
Рисунок 1: Схема респирометрии высокого разрешения на образцах пермеабилизированных скелетных мышц. Метод, подробно описанный в данной рукописи, разделен на 6 разделов: 1) приготовление дыхательных буферов и реагентов, 2) подготовка инструмента и реагента в день анализа, 3) подготовка и пермеабилизация мышечных образцов, 4) подготовка образца и инструмента, 5) проведение анализа дыхания и 6) анализ данных. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

1. Подготовка к анализу и калибровка прибора

  1. В день проведения анализа удалите необходимое количество аликвот каждого дыхательного соединения (блеббистатин, пальмитоилкарнитин, глутамат, малат, АДФ, сукцинат, цитохром С, FCCP) и разморозьте на льду. Разморозьте флаконы BIOPS и MiR05 на льду.
  2. Приготовьте растворы сапонина и пирувата, как указано в таблице 1. Приготовьте рабочий раствор MiR05 как показано в таблице 1. Приготовьте 5 мл рабочего раствора MiR05 на инструмент (2 камеры). Увеличивайте масштаб по мере необходимости.
  3. Включите систему респирометрии высокого разрешения и вакуумную систему. Снимите пробки, вакуумируйте 70% раствор для хранения этанола и снова заполните камеру сверхчистым молекулярным веществом класса H2O. Удалите H2O с помощью вакуума и снова наполните. Повторите в общей сложности 3 стирки. После окончательного промывания добавьте по 2 мл MiR05 (без креатина или блеббистатина) в каждую камеру.
  4. Откройте программу для респирометрии. После того, как программное обеспечение запустится, откроется всплывающее окно для настроек инструмента. Установите скорость перемешивания камеры на 750 об/мин, температуру на 37 °C, интервал записи данных на 2 с. Установите коэффициент усиления на 1 и напряжение поляризации на 800 мВ для датчиков кислорода. Нажмите «Подключиться к оксиграфу », чтобы установить связь с прибором.
  5. После установления связи откроется диалоговое окно для присвоения имени и сохранения экспериментального файла. Сохраните файл с текущей датой и калибровкой. После сохранения файла появится всплывающее диалоговое окно с подробными сведениями об эксперименте. Для выполнения калибровки не требуется никакой информации, и коробку можно закрыть.
  6. Регистрируйте концентрацию кислорода в течение не менее 30 минут, чтобы дать камерам прогреться и записать сигналы для калибровки воздуха. Это можно сделать во время подготовки мышечных волокон, как подробно описано в шаге 2 ниже.
  7. В конце периода калибровки отметьте область калибровки в области, где концентрация кислорода стабильна (синяя линия). Для этого, удерживая нажатой клавишу Shift и левую кнопку мыши , перетащите курсор по региону на временной шкале.
  8. Откройте окно калибровки, перейдя в раздел Oxygraph > O2 Calibration. В поле Воздушная калибровка выберите метку, сгенерированную на шаге 1.8. Нажмите «Калибровать и скопировать в буфер обмена».
  9. Повторите шаги 1.6-1.8 для оставшейся камеры. Выполняйте ежедневную калибровку воздуха. Остановите запись калибровки воздуха и сохраните файл, отключив его от прибора. После того, как образцы будут готовы, переходим к шагу 3 для проведения анализа.

2. Забор и пермеабилизация скелетных мышечных волокон

  1. Выделение тканей мышей
    1. Для каждого анализируемого образца заполните одну лунку 12-луночной чашки для посева 1 мл биопса. Поставьте тарелку на лед, чтобы она остыла.
    2. После усыпления мыши путем вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки соберите интересующую скелетную мышцу, обязательно удалив всю соединительную ткань и жир (рисунок 2A). Поместите мышцу в одну из лунок, содержащих биопсы. Выложите на лед до образования волокна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любая скелетная мышца может быть исследована с помощью этого протокола - тип исследуемой мышцы будет зависеть от экспериментального вопроса, на который вы хотите ответить. В случае скелетных мышц со смешанными типами волокон, таких как икроножная мышца, можно разделить ткань на белые и красные участки, чтобы измерить преимущественно быстро сокращающиеся (белые участки) и преимущественно медленные сокращающиеся (красные участки) волокна (рисунок 2B).
  2. Выделение тканей человека
    1. Сбор ткани в соответствии с клиническим протоколом14. Быстро промойте ткань холодным стерильным PBS и поместите ее в коническую пробирку, содержащую 2 мл раствора BIOPS. Держите ткань на льду до подготовки волокна.
  3. Подготовка клетчатки
    1. Пермеабилизация будет проходить в 6-луночном планшете для культуры тканей. Добавьте 2 мл раствора BIOPS в один набор лунок и 2 мл MiR05 в другой набор лунок. Для каждой исследуемой пробы потребуется один комплект лунок.
    2. Упакуйте поднос со льдом и поставьте на лед стеклянную чашку Петри вверх дном. Обязательно всегда держите мышцу на льду.
    3. Перенесите собранные образцы мышц на охлажденную платформу чашки Петри с помощью щипцов. С помощью двух щипцов с тонкими наконечниками и препарирующего микроскопа с источником света аккуратно очистите ткань, удалив все сухожилия, фасции и жировую ткань, которые прикреплены к мышце.
    4. После того, как вся посторонняя немышечная ткань будет удалена, осторожно раздвиньте мышечные волокна с помощью щипцов с тонким наконечником, пока они не превратятся в небольшие пучки полупрозрачных волокон длиной от 0,75 до 1,0 мм (Рисунок 2C-D). После разделения волокон с помощью щипцов перенесите пучки волокон в лунку на 6-луночном планшете, содержащем раствор BIOPS на льду.
    5. Добавьте 20 мкл раствора сапонина 5 мг/мл в каждую лунку BIOPS и инкубируйте планшет на льду, осторожно укачивая в холодном помещении в течение 20 минут.
    6. После лечения сапонином перенесите мышечные волокна в лунку, содержащую MiR05, чтобы промыть перед анализом. Инкубировать на льду, осторожно укачивая в холодном помещении в течение 15 минут.
    7. После завершения инкубации волокон в MiR05 соберите волокна острыми щипцами и аккуратно промокните мышечные волокна насухо на салфетке. Поместите пластиковую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл на тонкие весы и поместите в пробирку 2-3 мг волокон. Запишите итоговый вес волокна на боковой стороне каждой трубки. Поставьте трубку на лед. Повторите то же самое с другими образцами. Сразу приступаем к шагу 3.

figure-protocol-8253
Рисунок 2: Разделение скелетных мышечных волокон мыши. (А) Общая морфология мышиночной икроножной мышцы после сбора урожая. (Б) Рассечение икроножной мышцы на красный (левый) и белый (правый) сегменты. (В) Механически разделенные мышечные волокна. (D) 10-кратное изображение успешно разделенных мышечных волокон. Масштабная линейка составляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Подготовка мышечных проб в репульсометре

  1. Откачайте пылесосом MiR05, используемый для калибровки прибора, как описано в шаге 1 выше, и добавьте 2,1 мл рабочего раствора MiR05 в каждую камеру.
  2. Запустите новый файл для эксперимента, используя те же настройки прибора, что описаны в шаге 1.5. над. Задайте имя файла и сохраните настройки.
  3. После установки имени файла следующее диалоговое окно экрана будет содержать конкретные сведения об эксперименте. Введите информацию об образце и вес каждого образца, добавленного в каждую камеру. Закройте диалоговое окно.
  4. Оказавшись в новом экспериментальном файле, установите калибровку, открыв окно O2 Calibration. Нажмите Копировать из файла и выберите файл, сохраненный на шаге 1.9. над. Нажмите кнопку «Калибровать и скопировать в буфер обмена ». Повторите процесс для оставшейся камеры.
  5. С помощью тонких щипцов осторожно перенесите пучки мышечных волокон в дыхательный раствор для соответствующей камеры. Повторите то же самое для оставшейся камеры.
  6. Установите пробки на камеру и осторожно наполовину закройте камеру, сдвинув пробки примерно на полпути ко дну. Как только уплотнительные кольца на стопорах войдут в зацепление со стенкой камеры и возникнет сопротивление, используйте вращающее движение, надавливая на него, чтобы закрыть. Когда камера закрыта наполовину, в верхней части камеры можно наблюдать небольшой пузырь воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пермеабилизированные волокна подвержены ограничениям диффузии кислорода при регулярных респираторных заболеваниях. Чтобы обойти это ограничение, анализ проводят при повышенной концентрации кислорода11.
  7. Наполните пластиковый шприц объемом 10 мл чистым кислородом из кислородного баллона. Поместите длинную тупую иглу, входящую в комплект инструмента, на шприц. Поместите иглу в первую камеру и медленно подавайте в камеру примерно 1 мл кислорода.
  8. Контролируйте концентрацию кислорода в камере в программном обеспечении для респирометрии. Когда концентрация кислорода в камере достигнет 350-400 нмоль/мл, осторожно поверните пробку, надавливая вниз, чтобы полностью закрыть камеру. Загляните в камеру и убедитесь, что на ней не осталось пузырьков воздуха. При наличии пузырьков воздуха осторожно и быстро откройте камеру, добавьте 100 мкл дополнительного рабочего раствора MiR05 и быстро снова закройте камеру. Повторите то же самое с остальными камерами.
  9. Концентрация кислорода должна поддерживаться на уровне выше 250 нмоль/мл во время анализа. Добавьте дополнительный кислород по мере необходимости, частично открыв камеру, добавив больше кислорода из шприца в пузырь воздуха и осторожно закрыв камеру снова.
  10. Нормализовать данные о потоке кислорода в соответствии с массой ткани, используемой для эксперимента. Чтобы скорректировать графики, измените компоновку так, чтобы она отражала O2 Flux (пмоль O2 / (s x mg)). В меню компоновки выберите компоновку 06 - Specific Flux per Unit Sample. Теперь данные будут представлены в нормализованном виде по количеству ткани в каждой камере.

4. Респирометрия высокого разрешения

  1. Когда концентрация кислорода (синяя линия) и потокО2 (красная линия) стабилизируются после добавления кислорода, начните протокол дыхания. Кислород можно считать стабильным, когда синяя линия плоская или медленно уменьшается. O2 флюс также должен быть плоским и в пределах 5 пмоль O2 /s x mg.
  2. Добавьте все реактивы с помощью стеклянных шприцев. Важно не использовать один и тот же шприц для субстратов, ингибиторов и разъединителей. Имейте отдельный шприц для каждого. После добавления каждого соединения записывайте поток кислорода в течение 1-2 минут после стабилизации частоты дыхания перед добавлением следующего реагента.
  3. Измерение дыхания
    1. С помощью стеклянного шприца объемом 10 мкл добавьте по 2,5 мкл 0,8 М малата в каждую камеру. Нажмите F4 , чтобы отметить временную шкалу, и пометьте метку M. Запишите стабильный поток O2 в течение 1-2 минут.
    2. Добавьте реагенты, специфичные для питательных веществ, как описано ниже.
      1. Аэробный гликолитический: Используя стеклянный шприц объемом 10 μЛ, добавьте 10 μЛ 2 М глутамата и 5 μЛ 2 М пирувата в каждую камеру. Нажмите F4 , чтобы отметить временную шкалу, и пометьте метку буквой G P. Запишите стабильный поток O2 в течение 1-2 минут.
      2. Жирные кислоты: С помощью стеклянного шприца объемом 10 мкл добавьте 10 мкл 2 М глутамата и 10 мкл 10 мл 10 мл пальмитоилкарнитина в каждую камеру. Нажмите F4 , чтобы отметить временную шкалу, и пометьте метку с помощью G PC. Зарегистрируйте стабильный потокО2 в течение 1-2 мин.
    3. С помощью стеклянного шприца объемом 25 мкл добавьте по 20 мкл 0,5 М (с MgCl2) АДФ в каждую камеру. Нажмите F4 , чтобы отметить временную шкалу, и пометьте метку ADP. Зарегистрируйте стабильный потокО2 в течение 1-2 мин.
    4. С помощью стеклянного шприца объемом 25 мкл добавьте по 20 мкл 1 М сукцината в каждую камеру. Нажмите F4 , чтобы отметить временную шкалу, и пометьте метку S. Запишите стабильный поток O2 в течение 1-2 минут.
    5. С помощью стеклянного шприца объемом 10 мкл добавьте по 5 мкл 4 мМ цитохрома С в каждую камеру. Нажмите F4 , чтобы отметить временную шкалу, и пометьте метку Cyt C. Запишите стабильный поток O2 в течение 1-2 минут.
    6. Титруйте в трех болюсах объемом 1 мкл по 1 мМ FCCP с помощью стеклянного шприца объемом 10 мкл. Как правило, при добавлении FCCP возникает эффект смешивания, который приводит к кратковременному снижению уровня потокаO2 . Подождите, пока поток O2 увеличится и стабилизируется, прежде чем переходить к следующему шагу. Нажимайте клавишу F4 после каждого сложения, чтобы отметить временную шкалу и метку FCCP. Регистрируйте стабильный потокО2 в течение 1 мин после каждого добавления.
  4. Когда анализ дыхания будет завершен, аккуратно снимите пробки, поворачивая и потягивая вверх. Промойте камеры 3 раза сверхчистым H2O из бутылки для распыления, а затем 3 раза с 70% этанолом из бутылки для распыления. После окончательной промывки этанолом заполните камеры 70% этанолом для хранения.
  5. Установите стопоры в камерах до тех пор, пока не почувствуете сопротивление. Не закрывайте пробки до упора. Наденьте колпачки на пробки, сохраните файл анализа и отключите прибор от программного обеспечения Respirometry. Выключите прибор.

5. Анализ данных

  1. Откройте файл анализа в программе для респирометрии. Извлечение данных из областей стабильного потока кислорода, полученных после введения дыхательных соединений.
  2. Чтобы отметить области интереса, удерживайте нажатой клавишу Shift , нажмите левую кнопку мыши и перетащите рамку черезобласть стабильной скорости потока О2 для стадий анализа, описанных ниже.
  3. Стадии пробы 14,15,16,17,18,19,20
    1. Отметьте временные рамки после добавления малата/глутамата/пирувата (аэробный гликолитический протокол) или малата/глутамата/пальмитоилкарнитина (протокол жирных кислот). Эта скорость представляет собой частоту дыхания в комплексе I состояния 2 (LEAK(n)).
    2. Отметьте временную шкалу после добавления ADP. Эта частота представляет собой частоту дыхания Complex I State 3 (CI OXPHOS).
    3. Отметьте сроки после добавления сукцината. Эта скорость представляет собой частоту дыхания комплекса I+II состояния 3 (CI+II OXPHOS).
    4. Отметьте временную шкалу после добавления цитохрома С. Эта скорость представляет собой частоту дыхания комплекса I+II+Цитохром состояния 3 (CI+II+Cyt C OXPHOS).
    5. Отметьте временную шкалу титрования FCCP с максимальной скоростью потокаO2 . Эта частота представляет собой максимальную частоту дыхания (MAX ETS).
  4. Чтобы получить значения данных для отмеченных областей на временной шкале, выберите «Пометить > статистике». Скопируйте O2 Flux Rate (пмоль O2/(s x mg)) для отмеченной камеры в таблицу.
  5. Повторите маркировку и извлечение данных для дополнительных камер.
  6. Рассчитайте коэффициент контроля дыхания (ПДД), разделив Комплекс I+II Состояние 3 (после добавления сукцината) на Комплекс I Состояние 2 (до добавления АДФ).

Результаты

На рисунках 3 и 4 показаны графики содержания кислорода аэробных гликолитических протоколов и протоколов респирометрии жирных кислот, соответственно, для правильно подготовленных мышиных красных и белых икроножных мышечных мышечных волокон. Также приведены репрезентативные количественные результаты для справки. На рисунке 5 показан график аэробной гликолитической респирометрии в образцах биопсии мышц человека, которые были должным образом подготовлены. Также приведены репрезентативные количественные результаты. Обратите внимание, что на рисунках 3, 4 и 5 добавление цитохрома С после добавления АДФ не оказывает влияния на поток кислорода, что указывает на то, что внешняя митохондриальная мембрана образца не повреждена. На рисунке 6 показан график аэробной гликолитической респирометрии, где добавление цитохрома С после АДФ приводит к резкому увеличению потока кислорода (на 40%), что указывает на то, что внешняя митохондриальная мембрана была повреждена, и поэтому образец не следует использовать для респирометрии - потенциальными причинами этого результата могут быть неправильное обращение или замораживание/размораживание ткани. продлить проникновение тканей, причем не используя только что выделенную ткань.

figure-results-1565
Рисунок 3: Потребление кислорода мышами. Результаты показывают потребление кислорода в (А) красном и (В) белом икроножных икроножных мозгах при использовании пируватного протокола. Состояние 2 флюса после добавления малата, глутамата и пирувата (синий оттенок, CI LEAK). Значительная стимуляцияпотребления О2 наблюдается после введения АДФ (зеленый оттенок, CI OXPHOS), при этом дыхание усиливается после добавления сукцината (фиолетовый оттенок, CI+II OXPHOS). Цитохром С не индуцировал значительного увеличения (<15%), что указывает на то, что внешняя мембрана митохондрий не повреждена (оранжевый оттенок, CI+II+Cyt C OXPHOS). Митохондрии разъединяются после добавления FCCP (желтый оттенок, MAX ETS). Синяя линия представляет концентрацию кислорода в закрытой камере. Красная линия представляет скорость потребления кислорода (потокО2 ). Добавляемые соединения: малат (m), глутамат (g), пируват (p), аденозиндифосфат (ADP), цитохром C (cyt c), карбонильцианид-p-трифторметоксифенилгидразон (FCCP). (C) Гистограмма отражает репрезентативные результаты (n=8). Данные представлены в виде ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3114
Рисунок 4: Потребление кислорода мышью. Результаты показывают потребление кислорода в (А) красном и (В) белом икроножных пузырях с использованием протокола пальмитоилкарнитина. Состояние потока 2 после добавления малата, глутамата и пальмитоилкарнитина (синий оттенок, CI LEAK). Значительная стимуляцияпотребления О2 наблюдается после введения АДФ (зеленый оттенок, CI OXPHOS), при этом дыхание усиливается после добавления сукцината (фиолетовый оттенок, CI+II OXPHOS). Цитохром С не индуцировал значительного увеличения (<15%), что указывает на то, что внешняя мембрана митохондрий не повреждена (оранжевый оттенок, CI+II+Cyt C OXPHOS). Митохондрии разъединяются после добавления FCCP (желтый оттенок, MAX ETS). Синяя линия представляет концентрацию кислорода в закрытой камере. Красная линия представляет скорость потребления кислорода (потокО2 ). Добавляемые соединения: малат (m), глутамат (g), пальмитоилкарнитин (pc), аденозиндифосфат (ADP), цитохром C (cyt c), карбонилцианид-p-трифторметоксифенилгидразон (FCCP). (C) Гистограмма отражает репрезентативные результаты (n=7). Данные представлены в виде ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4682
Рисунок 5: Репрезентативные результаты по потреблению кислорода в латеральной мышце человека с использованием протокола пирувата. (A) Состояние потока 2 после добавления малата, глутамата и пирувата (синий оттенок, CI LEAK). Значительная стимуляцияпотребления О2 наблюдается после введения АДФ (зеленый оттенок, CI OXPHOS), при этом дыхание усиливается после добавления сукцината (фиолетовый оттенок, CI+II OXPHOS). Цитохром С не индуцировал значительного увеличения (<15%), что указывает на то, что внешняя мембрана митохондрий не повреждена (оранжевый оттенок, CI+II+Cyt C OXPHOS). Митохондрии разъединяются после добавления FCCP (желтый оттенок, MAX ETS). Синяя линия представляет концентрацию кислорода в закрытой камере. Красная линия представляет скорость потребления кислорода (потокО2 ). Добавляемые соединения: малат (m), глутамат (g), пируват (p), аденозиндифосфат (ADP), цитохром C (cyt c), карбонильцианид-p-трифторметоксифенилгидразон (FCCP). (B) Гистограмма отражает репрезентативные результаты, полученные при биопсии латеральной мышцы (n = 24). Данные представлены в виде ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6213
Рисунок 6: Репрезентативный результат, демонстрирующий нарушенную целостность внешней митохондриальной мембраны у мышиного красного икроножного мозга. Состояние 2 флюса после добавления малата, глутамата и пирувата (синий оттенок, CI LEAK). Значительная стимуляцияпотребления О2 наблюдается после введения АДФ (зеленый оттенок, CI OXPHOS), при этом дыхание усиливается после добавления сукцината (фиолетовый оттенок, CI+II OXPHOS). Цитохром С индуцировал значительное увеличение потребленияO2 (>15%), что указывает на повреждение внешней митохондриальной мембраны. Синяя линия представляет концентрацию кислорода в закрытой камере. Красная линия представляет скорость потребления кислорода (потокО2 ). Добавляемые соединения: малат (m), глутамат (g), пируват (p), аденозиндифосфат (ADP), цитохром C (cyt c), карбонильцианид-p-трифторметоксифенилгидразон (FCCP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Реагентное приготовление дыхательных соединений и дыхательных растворов. Представлена подробная информация о приготовлении реагентов, необходимых для анализа, в том числе о конечных концентрациях в запасе, а также о том, как их готовить и хранить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Этот протокол представляет собой всеобъемлющий и простой шаблонный протокол для оценки функции митохондрий в пермеабилизированных скелетных мышечных волокнах как для человека, так и для мыши. Есть несколько преимуществ использования пермеабилизированных волокон вместо изолированных митохондрий. Одним из ключевых преимуществ является то, что использование пермеабилизированных волокон требует небольшого (2-5 мг) количества ткани, что делает этот метод подходящим как для образцов биопсии мышц человека, так и для мышц мыши. Еще одним преимуществом по сравнению с изолированными митохондриями является то, что клеточная архитектура остается нетронутой, обеспечивая сохранение структурных и функциональных взаимодействий между митохондриями и клеточными компонентами 12,21,22,23.

Использование пирувата, малата и глутамата в нашем аэробном гликолитическом протоколе обеспечивает всестороннюю оценку широкого спектра поступления НАДН в комплекс I 24,25,26,27,28. В то время как этот комплексный подход обеспечивает оценку активности Комплекса I в холистических и физиологически значимых метаболических условиях, использование пируват-малата или глутамат-малата может быть более подходящим экспериментальным подходом. Например, использование глутамат-малата может выявить различия в функции митохондрий, связанные с катаболизмом аминокислот29. Мы призываем исследователей тщательно продумать подходящий подход, который следует использовать для их конкретной исследовательской модели.

В то время как этот протокол сосредоточен на использовании субстратов для оценки митохондриальной активности, использование специфических ингибиторов может быть необходимо для достижения экспериментальных целей. Например, ротенон может быть использован для ингибирования комплекса I 12,21,30, олигомицин для ингибирования комплекса V (АТФ-синтазы)12,21 и антимицин А для блокирования комплекса III12,21 для оценки немитохондриального дыхания. Приведенный выше протокол может быть легко адаптирован для включения в него использования специфических ингибиторов. Следует отметить, что одно предостережение относительно использования ингибиторов заключается в том, что эти соединения липкие и требуют тщательной очистки для удаления из камеры инструмента. Мы считаем, что использование раствора 10% БСА в течение 60 мин достаточно для удаления остаточных ингибиторов.

Дыхание LEAK относится к скорости потребления кислорода, которая не зависит от синтеза АТФ. Эта скорость представляет собой поток протонов обратно в митохондриальный матрикс через внутреннюю митохондриальную мембрану. Существует три общепринятых метода оценки потребления кислорода, не зависящих от синтеза АТФ (LEAK). Первый, LEAK(n), измеряет скорость потребления кислорода в присутствии субстратов, но без добавления аденилатов (АДФ или АТФ)31,32,33. Это состояние LEAK представляет собой внутреннюю негерметичность митохондриальной мембраны. Второй метод, LEAK(t), измеряют в присутствии АТФ34, а третий, LEAK(o), измеряют в присутствии ингибитора АТФ-синтазы олигомицина 35,36,37. В данном протоколе для этой оценки используется LEAK(n), но в зависимости от экспериментальных целей и моделей могут быть целесообразными другие методы измерения потока кислорода LEAK.

Для этого анализа MiR05 дополняют как креатином (3 мг/мл), так и блеббистатином (10 мкМ). Митохондриальный транспорт АДФ облегчается креатинкиназой (КФК), и креатин добавляется в дыхательный раствор для насыщения активности КФК38,39. Мышечные волокна могут спонтанно сокращаться, а также чувствительны к сокращению, вызванному АДФ. Для оценки митохондриальной дыхательной активности без влияния сокращения был добавлен блеббистатин, ингибирующий сократительную активность волокон38. Кроме того, исследования мышц человека показывают, что на дыхательную способность может влиять метод биопсии (микробиопсия в сравнении с иглой Бергстрома) и что эта разница может быть обусловлена различиями в длине полученных волокон40,41. Более короткие волокна могут быть более восприимчивы к повреждениям во время приготовления, а использование блеббистатина помогает сохранить функцию. Могут быть определенные условия, при которых релаксация волокон не соответствует целям исследования, и в этом случае блеббистатин может быть исключен из раствора MiR05.

Пермеабилизация скелетных мышечных волокон сапонином генерирует поры в плазматической мембране, позволяет субстратам и ингибиторам свободно проникать в клетку. Сапонин обладает высоким сродством к холестерину, которым богато и много в клеточных плазматических мембранах, в то время как митохондриальные мембраны бедны холестерином42,43. Ожидается, что обработка сапонинами, используемая для получения волокон в этом протоколе, сохранит целостность митохондриальной мембраны. Повреждение митохондрий также может произойти из-за сил сдвига, возникающих в результате механического разделения ткани на волокна. Мы предлагаем проводить разделение ткани на пучки волокон быстро и с минимальными манипуляциями. Чтобы оценить потенциальное повреждение митохондрий, мы включили титрование цитохрома С в протокол дыхания. Цитохром С не может проходить через неповрежденную внешнюю митохондриальную мембрану12, поэтому любое увеличение потокаО2 после добавления цитохрома С указывает на то, что повреждение наружной митохондриальной мембраны произошло в процессе подготовки образца. В одном из наших недавних исследований мы обнаружили, что потокO2 увеличился на 8%15 после добавления цитохрома С, подтверждая, что использование сапонина, предложенное в этом протоколе, не вызывает повреждения митохондрий. Мы полагаем, что любой образец, демонстрирующий более чем 15%-ное увеличение потокаО2 после добавления цитохрома С, должен быть исключен из анализа44. Этот этап включен строго в качестве меры контроля качества, а не в качестве оценки активности Комплекса IV.

В то время как респирометрия высокого разрешения превосходна в обеспечении высокочувствительных и надежных измерений потребления кислорода, заметным ограничением приборов является то, что на одном приборе можно одновременно измерять только два образца. Это требует тщательного рассмотрения при планировании исследований с участием когорт с несколькими выборками. Несмотря на то, что может возникнуть соблазн проводить измерения на различных наборах образцов в течение дня, мы настоятельно рекомендуем исследователям учитывать влияние циркадного ритма на метаболизм. Исследования скелетных мышц человека и грызунов выявили влияние биологических часов на функцию митохондрий45,46. Следовательно, мы рекомендуем проводить измерения в течение нескольких дней в одно и то же время суток, чтобы учесть эти циркадные колебания.

Наконец, для обеспечения воспроизводимых и надежных измерений респирометрии респирометр должен регулярно очищаться, обслуживаться и калиброваться. Калибровка воздуха, как подробно описано в протоколе, должна проводиться ежедневно. Мы также рекомендуем пользователям проводить полную ежемесячную калибровку (как воздушную, так и нулеваю) полярографических датчиков кислорода. Пользователям следует обратиться к документации производителя и веб-сайту для получения дополнительной информации об этом методе калибровки и инструкций по планировочному обслуживанию прибора.

Респирометрия высокого разрешения остается золотым стандартом измерения митохондриального дыхания. Метод, подробно описанный в этом протоколе, способствует надежной оценке митохондриальной способности как в скелетных мышцах грызунов, так и в мышцах человеческого скелета. Этот протокол был применен к исследованиям, оценивающим функцию митохондрий, связанную с генетическими мышиными моделями15,16, в контексте хронической болезни почек19, после приема пищевой добавки14,20 и физических упражнений17,18.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Исследовательским центром питания и ожирения, грантом NIH P30 DK056341 и грантом NIH K01 HL145326.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL Hamilton Syringe (glass syringe)ThermoFisher14-813-125For respiration assay titration
25 µL Hamilton Syringe (glass syringe)ThermoFisher14-813-133For respiration assay titration
ADPMerck117105Respirometry Assay
Black Glass Dissection DishScinticaDD-90-S-BLKFor sample preparation
BlebbistatinSigmaB0560Working MiR05 Solution
BSA, fatty acid freeSigmaA6003MiR05 Solution
Calcium CarbonateSigmaC4830BIOPS Solution
CreatineSigma27900Working MiR05 Solution
Cytochrome CSigmaC7752Respirometry Assay
DatLabOroboros InstrumentsN/ARespirometry Software
Dithiothreitol (DTT) SigmaD0632BIOPS Solution
D-SucroseSigma84097MiR05 Solution
EGTASigmaE4378BIOPS & MiR05 Solution
FCCPSigmaC2920Respirometry Assay
GlutamateSigmaG1626Respirometry Assay
HEPESSigmaH7523MiR05 Solution
Imidazole Sigma56750BIOPS Solution
KH2PO4 SigmaP5379MiR05 Solution
Lactobionic acidSigma153516MiR05 Solution
MalateSigmaM1000Respirometry Assay
MES hydrate SigmaM8250BIOPS Solution
MgCl2 - 6 H2O SigmaM2670BIOPS & MiR05 Solution
Oroboros Oxygraph-2K (O2K) SystemOroboros Instruments10203-03High resolution respirometer
Palmitoyl-CarnitineSigmaP4509Respirometry Assay
Potassium HydroxideSigmaP1767BIOPS Solution
Precision TweezersFisher17-467-168For sample preparation
SaponinSigmaS2149For Fiber Permeabilization
Sodium ATPSigmaA2383BIOPS Solution
Sodium PhosphocreatineSigmaP7936BIOPS Solution
Sodium PyruvateSigmaP2256Respirometry Assay
SuccinateSigmaS2378Respirometry Assay
Taurine SigmaT0625BIOPS & MiR05 Solution

Ссылки

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (9), 566-578 (2012).
  2. Ruegsegger, G. N., Creo, A. L., Cortes, T. M., Dasari, S., Nair, K. S. Altered mitochondrial function in insulin-deficient and insulin-resistant states. J Clin Invest. 128 (9), 3671-3681 (2018).
  3. Simoneau, J. A., Kelley, D. E. Altered glycolytic and oxidative capacities of skeletal muscle contribute to insulin resistance in NIDDM. J Appl Physiol. 83 (1), 166-171 (1997).
  4. Ryan, T. E., et al. Extensive skeletal muscle cell mitochondriopathy distinguishes critical limb ischemia patients from claudicants. JCI Insight. 3 (21), 123235(2018).
  5. Sullivan, M. J., Green, H. J., Cobb, F. R. Skeletal muscle biochemistry and histology in ambulatory patients with long-term heart failure. Circulation. 81 (2), 518-527 (1990).
  6. Giebelstein, J., et al. The proteomic signature of insulin-resistant human skeletal muscle reveals increased glycolytic and decreased mitochondrial enzymes. Diabetologia. 55 (4), 1114-1127 (2012).
  7. Tezze, C., et al. Age-associated loss of OPA1 in muscle impacts muscle mass, metabolic homeostasis, systemic inflammation, and epithelial senescence. Cell Metab. 25 (6), 1374-1389 (2017).
  8. Hughes, M. C., et al. Early myopathy in Duchenne muscular dystrophy is associated with elevated mitochondrial H(2) O(2) emission during impaired oxidative phosphorylation. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 10 (2), 643-661 (2019).
  9. Yin, Y., Shen, H. Common methods in mitochondrial research (Review). Int J Mol Med. 50 (4), 5182(2022).
  10. Vue, Z., et al. 3D reconstruction of murine mitochondria reveals changes in structure during aging linked to the MICOS complex. Aging Cell. 22 (12), e14009(2023).
  11. Doerrier, C., et al. High-resolution fluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  12. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  13. Picard, M., Hepple, R. T., Burelle, Y. Mitochondrial functional specialization in glycolytic and oxidative muscle fibers: tailoring the organelle for optimal function. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (4), C629-C641 (2012).
  14. Yoshino, M., et al. Nicotinamide mononucleotide increases muscle insulin sensitivity in prediabetic women. Science. 372 (6547), 1224-1229 (2021).
  15. Mousa, M. G., et al. Site-1 protease inhibits mitochondrial respiration by controlling the TGF-beta target gene Mss51. Cell Rep. 42 (4), 112336(2023).
  16. Moon, S. H., et al. Genetic deletion of skeletal muscle iPLA(2)gamma results in mitochondrial dysfunction, muscle atrophy and alterations in whole-body energy metabolism. iScience. 26 (6), 106895(2023).
  17. Bittel, A. J., et al. A single bout of premeal resistance exercise improves postprandial glucose metabolism in obese men with prediabetes. Med Sci Sports Exerc. 53 (4), 694-703 (2021).
  18. Bittel, A. J., et al. A single bout of resistance exercise improves postprandial lipid metabolism in overweight/obese men with prediabetes. Diabetologia. 63 (3), 611-623 (2020).
  19. Bittel, D. C., Bittel, A. J., Varadhachary, A. S., Pietka, T., Sinacore, D. R. Deficits in the skeletal muscle transcriptome and mitochondrial coupling in progressive diabetes-induced CKD relate to functional decline. Diabetes. 70 (5), 1130-1144 (2021).
  20. Mills, K. F., et al. Long-term administration of nicotinamide mononucleotide mitigates age-associated physiological decline in mice. Cell Metab. 24 (6), 795-806 (2016).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985(2017).
  22. Lemieux, H., Semsroth, S., Antretter, H., Hofer, D., Gnaiger, E. Mitochondrial respiratory control and early defects of oxidative phosphorylation in the failing human heart. Int J Biochem Cell Biol. 43 (12), 1729-1738 (2011).
  23. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  24. Appelman, B., et al. Muscle abnormalities worsen after post-exertional malaise in long COVID. Nat Commun. 15 (1), 17(2024).
  25. O'Rourke, A. R., et al. Impaired muscle relaxation and mitochondrial fission associated with genetic ablation of cytoplasmic actin isoforms. FEBS J. 285 (3), 481-500 (2018).
  26. Inigo, M. R., et al. Estrogen receptor-alpha in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Mol Metab. 34, 1-15 (2020).
  27. Musci, R. V., et al. Phytochemical compound PB125 attenuates skeletal muscle mitochondrial dysfunction and impaired proteostasis in a model of musculoskeletal decline. J Physiol. 601 (11), 2189-2216 (2023).
  28. Englund, D. A., et al. p21 induces a senescence program and skeletal muscle dysfunction. Mol Metab. 67, 101652(2023).
  29. Zhang, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly regulates metabolic features and glutamine dependency in mammalian cells. Theranostics. 13 (10), 3165-3187 (2023).
  30. Davis, M. S., Barrett, M. R. High-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle. J Vis Exp. (192), e65075(2023).
  31. Schytz, C. T., et al. Skeletal muscle mitochondria demonstrate similar respiration per cristae surface area independent of training status and sex in healthy humans. J Physiol. 602 (1), 129-151 (2024).
  32. Hingst, J. R., et al. Inducible deletion of skeletal muscle AMPKalpha reveals that AMPK is required for nucleotide balance but dispensable for muscle glucose uptake and fat oxidation during exercise. Mol Metab. 40, 101028(2020).
  33. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  34. Gnaiger, E., Mendez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  35. Basse, A. L., et al. Nampt controls skeletal muscle development by maintaining Ca(2+) homeostasis and mitochondrial integrity. Mol Metab. 53, 101271(2021).
  36. Flensted-Jensen, M., et al. Combined changes in temperature and pH mimicking exercise result in decreased efficiency in muscle mitochondria. J Appl Physiol. 136 (1985), 79-88 (2024).
  37. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (3), E224-E232 (2015).
  38. Perry, C. G., et al. Inhibiting myosin-ATPase reveals a dynamic range of mitochondrial respiratory control in skeletal muscle. Biochem J. 437 (2), 215-222 (2011).
  39. Veksler, V. I., et al. Muscle creatine kinase-deficient mice. II. Cardiac and skeletal muscles exhibit tissue-specific adaptation of the mitochondrial function. J Biol Chem. 270 (34), 19921-19929 (1995).
  40. Isner-Horobeti, M. E., et al. Microbiopsies versus Bergstrom needle for skeletal muscle sampling: impact on maximal mitochondrial respiration rate. Eur J Appl Physiol. 114 (5), 885-889 (2014).
  41. Hughes, M. C., et al. Mitochondrial bioenergetics and fiber type assessments in microbiopsy vs. Bergstrom percutaneous sampling of human skeletal muscle. Front Physiol. 18 (6), 360(2015).
  42. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  43. Elustondo, P., Martin, L. A., Karten, B. Mitochondrial cholesterol import. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1862 (1), 90-101 (2017).
  44. Ramos, P. M., Li, C., Elzo, M. A., Wohlgemuth, S. E., Scheffler, T. L. Mitochondrial oxygen consumption in early postmortem permeabilized skeletal muscle fibers is influenced by cattle breed. J Anim Sci. 98 (3), 044(2020).
  45. van Moorsel, D., et al. Demonstration of a day-night rhythm in human skeletal muscle oxidative capacity. Mol Metab. 5 (8), 635-645 (2016).
  46. de Goede, P., et al. Time-restricted feeding during the inactive phase abolishes the daily rhythm in mitochondrial respiration in rat skeletal muscle. FASEB J. 36 (2), e22133(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены