Этот протокол используется в настоящее время в нашей лаборатории и был усовершенствован в течение ряда лет многие люди, включая доктора Дэвида Шарпа, Mijung Квон, Патриция Sommi, Dhanya Cheerambathur. Мы благодарим Д-р Билл Салливан (УСК), который предоставил нам отличный совет на манипуляции и микроинъекции ранних эмбрионов дрозофилы, когда наша работа в этой системе в настоящее время начато (см. 13). Мы благодарим всех членов лаборатории Шоли. Наша работа на митоз у дрозофилы при поддержке гранта NIH GM55507.

Рецепты: Пластины Виноградный сок: <ul><li> 5,5 г Бакто агар </li><li> 14,5 г декстрозы или глюкозы </li><li> 7,15 г сахарозы </li><li> 45 мл концентрата виноградного сока (100% сока). </li><li> 204,5 мл H 2 0 </li><li> 625 мкл 10N NaOH </li></ul> Смешайте все ингредиенты и СВЧ до кипения. Добавить 2,8 мл кислоты смеси (смеси кислот: 20,9 мл пропионовой кислоты, 2,1 мл фосфорной кислоты, 27 мл H 2 0) Смешать и вылить на 35 мм чашки Петри. Давайте затвердевают при комнатной температуре в течение одного или двух дней. Если таблички не будет использоваться в ближайшее время, печать с парафильмом и хранить при температуре 4 ° C (разрешить, чтобы уравновесить до комнатной температуры перед использованием). Дрожжи пасты: Растворяют около одной чайной ложки дрожжей (Sigma YSC2, дрожжи Saccharomyces от CEREVISIAE тип II) в воде с образованием густой пасты. Нанесите небольшое количество этого на каждой пластине винограда сок непосредственно перед использованием. G-PEM буфера: <ul><li> 80 мМ Na-ТРУБЫ, рН 6,9 </li><li> 1 мМ MgCl 2 </li><li> 1 мМ EGTA </li><li> 1 мМ GTP </li></ul> Инъекция буфера: <ul><li> 150 мМ К-аспартата </li><li> 10 мМ К-фосфатном </li><li> 20 мМ имидазола, рН 7,2 </li></ul> Гептан клея: Разверните двойной клейкой лентой и поместите в бутылку 100 мл, добавляют 50 мл гептана о, печать бутылку, и рок в течение нескольких дней. При использовании, добавьте гептан, если клей слишком густой. Обезвоживание камеры: Возьмите 100 мм чашки Петри, положите одну часть 35 мм блюдо внутри, чтобы сделать &quot;стол&quot; и добавить Drierite (безводный сульфат кальция) вокруг него так, чтобы высота Drierite не выше, чем &quot;стол&quot; и крышкой. Покровное с эмбрионами будут размещены на этом &quot;стол&quot; для обезвоживания перед инъекцией. Это хорошая идея использовать по крайней мере некоторые указали, Drierite и изменить его, когда он изменил цвет. Протокол: Этот протокол может быть использован для инъекций практически любой растворимый реагента в дрозофилы синцитиального эмбриона: Например, как флуоресцентный белок для наблюдения или ингибитором белка-мишени или обоих. Получение все готово: 1 .- 2 до 3 дней до начала эксперимента, сделать виноградный сок пластин и настроить лежала клетке: Возьмите пластиковую бутылку (6 унций с круглым дном из прикладных научных дрозофилы), вырезать два маленьких отверстия (около 1 см 2) на противоположных сторонах бутылку и залейте хлопка кусок (это позволит воздуху поток), нажмите мух в бутылку и залить виноградным соком пластины. Хранить при температуре 25 ° С (или при комнатной температуре), мухи должны заложить эмбрионов в течение приблизительно 10 дней. 2 .- По крайней мере, за один день до эксперимента вытащить иглы для инъекций, мы используем иглы Kopf / Внесите съемник модели 720 и тонкостенных стеклянных нитей (Всемирный точных приборов tw100f). Для инъекций флуоресцентных тубулина, держите иглы при 4 ° С, чтобы предотвратить температуры индуцированной полимеризации в иглу. Тубулина подготовки: Примечание: Все работы с тубулина должно быть сделано при 4 ° С для предотвращения полимеризации. <ol><li> Возьмите помечены тубулина из холодильника и положить его на льду в течение 5 до 15 минут. </li><li> Разбавить G-буфера PEM (от 4 до 10 раз в зависимости от интенсивности требуется). </li><li> Центрифуга на 13k оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 10-15 минут. </li><li> Нагрузка 1 - 2 мкл в иглу. </li></ol> Антитела или химического ингибитора: Подготовка иглы также для тубулина, с использованием соответствующей концентрации (это возможно, должны быть проверены). Антитело может быть в инъекции буфера, G-буфера или PEM PBS. Если другой буфер нужен, этот буфер должны быть введены в качестве контроля, чтобы убедиться, этот буфер не вызывает никаких повреждений сам по себе. Примечание: Ингибитор и флуоресцентные тубулина могут быть смешаны и вводят вместе, если концентрация позволяет. В противном случае, вводить флуоресцентные тубулина и ждать от 5 до 10 минут перед инъекцией ингибитора. При выполнении двойного впрыска, начните с более эмбрионов, так как меньше эмбрионов будет восстанавливаться в обычном режиме. Эмбрион коллекции: <ol><li> Положите новой пластинкой виноградного сока на клетке лежала. </li><li> Удалить эту пластину через час, это первый сборник день и часто не очень хорошо. Она может быть отброшена. </li><li> Изменение пластины каждый час, чтобы держать сбора эмбрионов в течение одного часа каждый. </li></ol> Покровное подготовки: <ol><li> Положите 50 х 22 мм покровным с одной стороны стекло микроскопа. Лента четырех углах на слайд, чтобы он не двигаться. </li><li> Использование хлопка наконечником аппликатором, положить в один слой клея гептана в одну линию на покровное (клей не должен быть вязким и должен сохнуть в течение нескольких секунд, в противном случае добавить еще гептана). </li><li> Положите кусокдвойной липкой лентой на сползание к стороне покровного стекла. </li></ol> Эмбрион подготовки: Примечание: Эмбрионы должны быть отображены около 2 часов после начала сбора, чтобы начать следующие шаги обеспечивают достаточное время, чтобы закончить их в течение этого периода времени. <ol><li> С смоченной кистью тщательно подобрать эмбрионов от пластины виноградным соком и положите на двойной липкой лентой на слайде. </li><li> Использование внешней части пинцет, рулон эмбрионов над двойной липкой ленты, пока хориона (наружной мембраны) разрывается. </li><li> Возьмите эмбриона, осторожно прокатки его над хориона так он прилипает к пинцет и поместите его на гептан клея на покровное с длинной стороне эмбриона параллельно длинной стороне покровного стекла. Настройка от 10 до 20 эмбрионов в одном ряду. </li><li> Удалить покровное и поместить его в камеру для обезвоживания 3 до 8 минут (это зависит от влажности помещения и суммы, который будет введен). </li><li> Место на металлической камеры с вакуумной смазкой. </li><li> Обложка эмбрионов с галоидоуглеводородов 700 масла, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Эмбрионы теперь готовы для инъекций. </li></ol> Эмбрион инъекций: <ol><li> Найти эмбрионов под 16x цели. </li><li> Перемещение эмбрионов далеко, и найти иголку без перемещения фокальной плоскости. </li><li> Центр иглы и переместить его вверх, не двигая его в х или у. </li><li> Если игла не открыто, положить край покровного в поле зрения, но не там, где игла будет, а нижняя игла же фокальной плоскости. Очень осторожно двигаться покровное, пока не встретит иглы и аккуратно разбивает его открытым. Если игла открытым, переходите к шагу 5. (Иглы можно открыть с помощью плавиковой кислоты до заполнения). </li><li> Положите эмбрионов с учетом (но не там, где игла будет), снижение иглу в нефти и убедитесь, что вы получите хорошие капли жидкости из иглы. </li><li> Осторожно, но уверенно двигаться эмбрион в иглу и вводят каплю в эмбрионе и двигаться эмбриона прочь. (Или следуйте инструкциям вашего инъекции аппарат). </li><li> В конце концов эмбрионы были введены, они готовы для наблюдения по конфокальной микроскопии. </li></ol> Получение изображений: Изображения эмбрионов на конфокальной микроскопии с 60 или 100X цель: Примечания: <ol><li> Отрезка времени, на серии промежуток времени должно быть не более нескольких секунд, так как митоз в эмбрион очень быстро, в зависимости от конкретного процесса, который будет изучен. </li><li> 3D-серии или одной плоскости может быть приобретено в зависимости от процесса, представляющих интерес. </li><li> Для быстрого действия ингибиторов, переход от инъекций микроскоп для визуализации микроскопа должно быть быстрым. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1: Изучение митоза у дрозофилы синцитиального эмбриона. Ядер в раннем эмбрионе претерпевают быстрое подразделений без цитокинеза, во время циклов с 10 по 13 ядер форме монослоя в коре головного мозга.. Схема раннего эмбриона с ядрами при коры головного мозга. Эмбрион может выразить GFP и / или RFP меченых белков и может быть microinjected с другими меченых белков и / или ингибиторов. Б. Временной интервал изображения эмбрионов выражения GFP-тубулина и RFP-гистонов. С. земельный полюс-полюс разделения циклов 11 , 12 и 13 в дикой эмбриона типа. Длина шпинделя экспонатов периодов изометрических длины и периоды относительного удлинения, которые очень последовательным и воспроизводимым. Д. Динамика микротрубочек веретена. Введение низких концентрациях родамина тубулина приводит к крапинками формируется из нескольких субъединиц тубулина, которые могут быть использованы для изучения динамики микротрубочек.

<ol>
	<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila.">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos.">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li><li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis.">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li><li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+anaphase+B:+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation.">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos.">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li><li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states.">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li><li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch:+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient.">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromokinesin,+KLP3A,+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility.">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos.">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li><li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+kinesin,+KLP61F,+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles.">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li><li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos.">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy,+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li></ol>

Этот протокол является относительно простым, тем не менее, каждый шаг требует практики, чтобы убедиться, эмбрионы не повреждены. Тщательные контрольные эксперименты всегда нужно сделать для того, что надежные результаты получаются. Один хороший способ начать это путем microinjecting буфера ?...

microinjection techniques for studying mitosis in the drosophila melanogaster syncytial embryo

Этот протокол описывает использование дрозофилы синцитиального эмбриона для изучения митоза 1. Дрозофилы имеет полезную генетики с геном последовательность, и ее можно легко сохранять и манипулировать. Многие мутанты митотической существует, и трансгенных мух выражения функциональных флуоресцентно (например, GFP) - меченый белков митотического были и в настоящее время генерируется. Целевые экспрессии генов можно с помощью системы GAL4/UAS 2. Дрозофилы раннего эмбриона проводит несколько митозов очень быстро (клеточного цикла продолжительность, ≈ 10 мин). Она хорошо подходит для работы с изображениями митоз, потому что во время циклов 10-13, ядра делятся быстро и синхронно, не вмешиваясь цитокинеза на поверхности эмбриона в одном монослое только под корой. Эти быстро делящихся ядер, вероятно, использовать те же механизмы митотического как и другие клетки, но они оптимизированы для скорости; контрольно-пропускного пункта, как правило, считается не строгим, позволяя изучение митотических белков, отсутствие которых может вызвать остановку клеточного цикла в клетках с сильным контрольно-пропускной пункт . Эмбрионы выражения GFP меченых белков или microinjected с флуоресцентно меченые белки могут быть легко отображаемого следовать жить динамики (рис. 1). Кроме того, эмбрионы могут быть microinjected с функцией блокировки антителами или ингибиторами специфических белков для изучения влияния потери или возмущении их функции 3. Эти реагенты могут диффундировать по всему эмбриона, достигнув многих шпинделей для получения градиента концентрации ингибитора, который, в свою очередь приводит к градиенту дефектов сравнимы с аллельных серий мутантов. В идеале, если целевой белок флуоресцентно меченных, градиент торможение может быть непосредственно визуализировать 4. Предполагается, что сильнейшие фенотип можно сравнить с нулевой фенотип, хотя трудно формально исключает возможность того, что антитела могут иметь доминирующую эффектов в редких случаях, так что строгий контроль и осторожная интерпретация должна быть применена. Подальше от укола, функции белка лишь частично потерял позволяющий другие функции белка-мишени, чтобы стать очевидным.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo at JoVE.com

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Этот протокол описывает использование микроинъекции и высоким разрешением в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Синцитиального эмбриона для изучения митоза.

Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

14.0K Views.  University of California, Davis. Этот протокол описывает использование микроинъекции и высоким разрешением в Дрозофилы Синцитиального эмбриона для изучения митоза.

Video: Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Электрофизиологические Запись в Drosophila Эмбрионов

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Мониторинг функции сердца в личинок Дрозофилы Для физиологических исследований

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых<em&gt; Drosophila</em&gt; Синцитиальный эмбрионов

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Изображений Через куколки случае<em&gt; Дрозофилы</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Улучшенная Северная Клякса обнаружения малых РНК видов в<em&gt; Дрозофилы</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.