Наш протокол может быть использован для определения пространственых и временных динамических событий во время митоза, а также может быть использован для визуализации воздействия митотических регуляторов в режиме реального времени. Использование двойной цветовой визуализации позволяет одновременно проводить анализ двух молекулярных маркеров. Например, мы можем визуализировать микротрубочки митотического шпинделя и кинетическую структуру ядра реплицированных хромосом.
Чтобы вызвать экспрессию флуоресцентного белка, через четыре дня после лечения РНК-интерференции, подвергайте слизистые металло-тианиновые промоторные трансфицированные клетки окончательной концентрации 500 микромоляных медных сульфатов в течение 24-36 часов. Чтобы подготовить флуоресцентный белок, выражаюющий клетки для визуализации, перенесите клетки в стерильную 15-миллилитровую трубку, а после подсчета осадков от осадки клеток центрифугировать. Resuspend гранулы в свежем, 25 градусов по Цельсию нагревается SIM, дополняется 10%FBS, в два раза от 10 до 6 клеток на миллилитр концентрации, и лечить клетки с дополнительными 500 микромолярный сульфат меди.
Затем добавьте от 200 до 500 микролитров клеток к одному колодец мульти-хорошо живой камеры клетки, и поместите камеру на перевернутой стадии флуоресцентного микроскопа. В то время как клетки оседают в камере, откройте программное обеспечение для визуализации живых клеток и нажмите на новое и поэкспериментируйте. Чтобы вставить цикл промежуток времени, над которым будут сделаны изображения, нажмите значок цикла промежуток времени.
Установите интервал на секунды и разделите желаемую общую продолжительность эксперимента на секунды с интервалом, чтобы установить количество циклов. Разрешить цикл повторить в течение желаемого общего периода времени. Чтобы вставить инфракрасную проверку фокусировки, чтобы сохранить фокус цели, нажмите значок перемещения XY и выберите компенсацию дрейфа, чтобы добавить шаг компенсации дрейфа в слое цикла промежуток времени.
Чтобы получить многоканабельное изображение, нажмите значок многоканазонной группы, чтобы добавить многоканабельный групповой слой, и нажмите на значок цикла стека, чтобы добавить слой цикла стека. Затем установите желаемый размер шага и количество срезов и установите экспозицию каждого канала как можно более низко, чтобы свести к минимуму отбеливание фотографий. Чтобы изображение деления клеток, выберите 40 или 60 раз цель погружения в нефть, и канал mCherry florescence, и выровнять цель вдоль верхней или нижней части хорошо.
Затем отойдете от вертикального делителя хорошо, чтобы избежать вмешательства в шаг компенсации дрейфа. Найдите ячейку или ячейки в поздней фазе G2 или на ранней фазе M и нажмите кнопку живого просмотра, чтобы начать просмотр ячеек на экране программного обеспечения. Поиск соответствующих ячеек при переходе G2 к M является ключом к визуализации деления клеток.
Найдите ячейку с нетронутым ядром и ровно двумя центросомами для получения наилучших результатов. Используя тонкую ручку фокусировки микроскопа, сосредоточьтесь на ячейках, представляющих интерес, и нажмите кнопку найти смещения, чтобы установить инфракрасную проверку фокусировки. Нажмите, чтобы инициировать программу визуализации промежуток времени, и выбрать нужный канал и настроить средние интенсивности пикселей, чтобы настроить гистограммы по мере необходимости, чтобы четко визуализировать ячейки, представляющие интерес.
Проверьте клетки через 15-20 минут, чтобы подтвердить, что разрушение ядерного конверта произошло, как это определено исчезновением круглого, темного преломленного пятна вблизи центра клетки. Еще через 15-20 минут проверьте, произошло ли начало анафазы. Затем остановите программу и сохраните файл.
Чтобы определить разбивку ядерной оболочки для анафазного времени начала, нажмите кнопку кадра вверх, чтобы определить время распада ядерного конверта и время первоначального разделения хромосомы в минутах, и вычесть время поломки с самого начала времени, чтобы получить ядерный разрыв конверта до времени начала анафазы для данной клетки. Затем продолжайте сканирование для предварительно делящихся ячеек, чтобы получить несколько концов для данного состояния на срок до 12 часов от первоначального урегулирования. Клетки, которые вот-вот разделят, могут быть направлены на наличие двух центросом и нетронутого ядра, о чем свидетельствует преломленный свет и более темное пятно внутри клетки при просмотре в альфа-тубулинском канале.
Распад ядерного конверта можно визуализировать через исчезновение этого темного пятна, что приводит к равномерной окраске цитоплазмы. После распада ядерного конверта, время, которое каждая клетка занимает, чтобы сформировать шпиндель и конгресс и сегрегации хромосомы могут быть измерены, увезрения времени точки этих событий по отношению к ядерной оболочки распада. Лечение двойной мель РНК направлены против shortstop, актин микротрубочек перекрестного белка, как подозреваемых повлиять на динамику клеточного цикла приводит к значительной задержке митотических.
Это лечение приводит к значительной задержке, со многими клетками арест на метафазе и никогда не переход к анафазе в течение всего двух-трехчасового эксперимента изображений. Совместное лечение с двухцепочеченной РНК против выстрела и грубой сделки, важным компонентом этого контрольно-пропускного пункта, приводит к подавлению фенотипа ареста, в результате чего ядерная оболочка распада анафазы раз похож на контролируемые, необработанные клетки. Обязательно выберите подходящие клетки и не тратьте время на визуализацию клеток, которые не начинают деление.
Если ячейка не начинает делиться в течение 20 минут, найдите другую ячейку. Исследователи могут следовать этой процедуре, чтобы помочь определить новые митотические регуляторы, или, возможно, новые сухие соединения, которые влияют на конкретные события в деление клеток.
