Авторы хотели бы выразить признательность Akira Chiba для интеллектуальной поддержки, материальной поддержки, и акции. Благодаря Юлии Dallman для комментариев.

1. Fly Работа <ol><li> Поддерживать мух на стандартной фуражное зерно-агар-патока-дрожжевой среде при комнатной температуре 10. </li><li> Для крестов, изолировать девственниц в пределах 6 часов от вылупления. После пересечения с мужчинами желаемого генотипа, изменение летит к новым флаконах каждые 3-4 дня. </li></ol> Примечание: Для этих экспериментов Gal4 линии A9 был использован для управления экспрессией трансгенов в крыле. Fly запасы могут быть получены из фондового центра в Блумингтон. Акции, используемые в этих экспериментах, включают A9-Gal4 (BL # 8761), His2Av-GFP (BL # 5941), ШОС / суо HsCre (BL # 1092), UAS-ChRFP-ванна (BL # 25773), lollibow 11. 2. Выбор и монтаж Куколки <ol><li> Стадия куколки либо путем сбора их в виде белого предкуколок (WPP) и держать их при 25 ° С, пока не достигнут соответствующего возраста или с помощью морфологических критериев 12. </li><li> Для наблюдения деления клеток, выберите куколки, которые недавно подверглись головы выворачивание.С этого времени, пока непосредственно перед вылупления (в&gt; 96 часов), куколки не неподвижны позволяя расширенный покадровой наблюдение. </li><li> Удалить куколок из флаконов, сначала касаясь их с кистью, смоченной в воде, ожидая в течение минуты, чтобы позволить воде, чтобы ослабить клей, а затем аккуратно подталкивая их на кисти. </li><li> Осторожно промыть выбранный куколок по подталкивая их с кистью в воде, чтобы удалить слюнные железы клейкие и частиц пищи. </li><li> Трансфер чистую куколки, чтобы блюдо 25 мм чашки с покровного нижней (число 1 ½ покровные). </li><li> Использование тонких полосок либо формовочной глины или зубной воск в качестве опоры, крепление куколок так, что ткань представляет интерес находится ближе всего к покровное. Примечание: В исследованиях, описанных здесь, были обнаружены куколки крылья, ноги, брюшной histoblasts или спинной Notum. На практике любой ткани в 20 мкм от поверхности куколки случае наблюдается. </li><li> Ориент куколки так тщательно, что Тканье интерес параллельна поверхности покровного стекла. </li><li> После того, как куколки установлены с помощью кисти для передачи тонкий слой тиодиэтиленгликол (TDG) в пространство между куколки и покровного стекла. </li></ol> Примечание: TDG уменьшает поверхностное рассеяние, соответствует показатель преломления масла, а также позволяет кислороду проникать в ткань 13. Использование масел не рекомендуется, так как они, как правило, лишает ткани кислорода, вызывая быстрое прекращение клеточных поведения. 3. Изображений Примечание: Для изображений, конфокальный микроскоп может иметь важное значение, поскольку confocality удалить большую часть затемн фоне вызванного интенсивной освещенности куколки случае. <ol><li> Настройка параметров на конфокальной чтобы свести к минимуму воздействие освещения на куколки развития и жизнеспособности. Чтобы сделать это, найти баланс между интенсивностью возбуждения и чувствительности коллекции. Типичная конфигурация для визуализации Wiй Leica SP5 использовал резонансную сканер (8000 Гц), мощность лазера установлен в 2% (10% пропускания от 20% мощности), пинхол набор до 120 мкм, и линия усреднения установлен до 8. Параметры будут меняться в зависимости от условий эксперимента. </li></ol> Примечание: Для решения прекрасно шкала имеет 40X и 63X Нефть погружения линз (0,1 мм рабочее расстояние) также успешно используемый в этом методе, хотя они ограничивают глубину резкости. 4. Анализ Для анализа кадров, Z-стеки или фильмы импортировать файлы данных на Фиджи, который имеет эффективные инструменты для просмотра, измерения и изменения файлов для презентации 14. Например время для завершения митоза была измерена с помощью интервал выборки и многомерный браузер изображений пошагово кадров во время просмотра клетку от профазы к телофазе. X-, Y-и Z-размеры можно измерить с помощью измерительного инструмента. Подробные инструкции по программному обеспечению и его использованиесм.: http://fiji.sc/Fiji.

<ol>
	<li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332, 354-358 (2011).</li><li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage:+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell.">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li><li>Ninov, N., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila.">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).</li><li>Edgar, B. A., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+cell+cycle+regulators:+a+fly's+perspective.">Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective.</a> Science. 274, 1646-1652 (1996).</li><li>Wirtz, R. A., Semey, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+kitchen:+equipment,+media+preparation,+and+supplies.">The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies.</a> Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).</li><li>Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+multicolor-labeled+cells+in+Drosophila.">Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila.</a> Development. 140, 1605-1613 (2013).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+is+a+broadly+conserved+feature+of+cell+division+in+pseudostratified+epithelia.">Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia.</a> Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).</li><li>Sauer, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Для визуализации, измерения и количественной характеристики делящихся клеток, необходимый разработки простого подготовки к наблюдая митоза в живом куколки крыла дрозофилы с помощью конфокальной анализа His2AvGFP экспрессирующих клеток. Этот метод был использован для документирова...

<html> Уксус муха, дрозофилы, является устоявшейся моделью для изучения многих аспектов биологии. Исследования дрозофилы имеет богатую историю генетического эксперимента, который позволяет изощренные формы генных манипуляций в том числе слова, нокдаун и мутации. С появлением флуоресцентный белок этикеток, это репертуар расширилась и теперь включает изучение клеток и белков в живых животных. Муха эмбрион является отличной системой для таких исследований, поскольку это маленькое и оптически ясно позволяя глубоко, с высоким разрешением изображения в естественных условиях 1-3. Другие этапы развития лету оказались менее сговорчивыми, требуя Наркоз 4, вскрытие и краткосрочный культуру 5,6, или создание окон в кутикулу для работы с изображениями 7,8. Эти манипуляции, как правило, компромисс развития животных в долгосрочной перспективе и не влияет на животное таким образом, чтобы ограничить изображений на короткие периоды. ЛОР &quot;&gt; Для изучения новых мутаций в генах, которые напоминают регуляторов клеточного цикла, необходимо было найти подходящую подготовку для изучения сроков и верность клеточного цикла. Поскольку обрезаются большинство эмбриональных клеточных циклов (SM или S-G2-M) и мутанты изучаемые не обнаруживают дефекты до более поздних стадиях, это не было важно соблюдать клеточный цикл в стадии куколки тканей. эпителиальных клеток в куколки имеют более типичный G1-S-G2-M клеточного цикла и куколки этой стадии не способны мышечных движений 9. Первоначальный отправной точкой для манипуляций включены нетронутыми все куколки, выразив Histone2AV-GFP. Несмотря на кажущуюся непрозрачности куколки случае это нетронутыми подготовка оказалась отлично подходит для долгосрочных в естественных изображений. Эта техника проста Достаточно того, что студенческие исследователи обычно используют его для изучения аспектов клеточной и эволюционной биологии у дрозофилы и все же разрешение является достаточно тонкой, чтобы позволить дискриминацию микрометр масштабных функций. С помощью этого метода, наблюдения событий более часов, минут или секунд возможны просто, регулируя параметры временных рядов. Видео с помощью синих, зеленых, желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, или их комбинации, были сделаны. Важно отметить, что, если приняты меры, чтобы минимизировать интенсивность лазера, даже долгосрочная изображений не имеет никакого влияния на развитие или жизнеспособности животных.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly stuff fly pad</td>
			<td style="width:71px;">Genesee scientific</td>
			<td style="width:119px;">59-114</td>
			<td style="width:167px;">for fly anesthetization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CO2 gas</td>
			<td style="width:71px;">Airgas south</td>
			<td style="width:119px;">CD50</td>
			<td>For fly anesthetization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas south</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>CO2 regulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly vials</td>
			<td style="width:71px;">Genesee scientific</td>
			<td>32-113RLBF</td>
			<td>Fly culture</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)</td>
			<td style="width:71px;">Bloomington Stock center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bottom dishes #1 1/2</td>
			<td style="width:71px;">WillCo Wells BV</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thiodiethylene Glycol</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">88559</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Modeling clay</td>
			<td style="width:71px;">art supply store</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Support to position pupae against</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paintbrushes</td>
			<td style="width:71px;">art supply store</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>To manipulate flies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Forceps, Inox #5</td>
			<td style="width:71px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">computer</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>8 Gb RAM for image/movie analysis</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">Fiji software</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;">Free ware http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Any fast scanning confocal should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For imaging tissue, cellular and subcellular features</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil (non fluorescent)</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For fly manipulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging through the pupal case of drosophila melanogaster

Давние использование дрозофилы в качестве модели для клеточной и эволюционной биологии дало широкий спектр инструментов. Вместе эти методы позволили анализ клеточной и эволюционной биологии из различных методологических углами. Онлайн изображений является новым методом наблюдения динамических процессов клеток, такие как деление клеток или клеточной подвижности. Выделив мутации в неохарактеризованных предполагаемых белков клеточного цикла это стало необходимо соблюдать митоза на месте с помощью живого изображения. Большинство живых изображений исследования у дрозофилы были сосредоточены на эмбриональной стадии, которые доступны для манипуляций и наблюдения из-за их небольшого размера и оптической прозрачности. Тем не менее, в этих стадий клеточного цикла необычен тем, что в нем отсутствует один или оба из фаз разрыв. В противоположность этому, клетки куколки крыла дрозофилы имеют типичный клеточный цикл и пройти период бурного митоза, охватывающую около 20 час из куколки развития. Легко Identify и изолировать куколок соответствующем этапе поймать митоза на месте. Монтаж нетронутыми куколки условии наилучшее сочетание сговорчивости и долговечность во время съемки, позволяя эксперименты для запуска в течение нескольких часов с минимальным воздействием на клетки и животных жизнеспособности. Метод позволяет наблюдать особенности как малые, как, или меньше, чем, летать хромосомы. Регулировка настроек микроскопа и детали крепления, позволило расширение подготовки визуализировать мембранные динамику соседних клеток и флуоресцентно меченных белков, таких как тубулина. Этот метод работает для всех тестируемых флуоресцентных белков и может захватить масштабные особенности субмикронных по множеству временных масштабах. В то время как ограничен наружной 20 мкм куколки с обычным конфокального микроскопа, этот подход к соблюдению белка и клеточных динамику в куколки тканей в естественных условиях в целом могут быть полезны при исследовании клеток и биологии развития в этих тканях.

Клетки эпителия псевдомногослойного, такие как развивающегося Drosophila глаз, или желудочковой слоя проявляющего позвоночных центральной нервной системы, претерпевают ядерного движений, называемых интеркинетической ядерного миграции во времени с клеточного цикла. Репликация ДНК ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Эта статья демонстрирует использование быстро сканирующей конфокальной микроскопии с поведением изображений клеток непосредственно через пупария. Задержите куколки дело нетронутыми, этот метод позволяет наблюдения и измерения динамических процессов клеточных на стадии разработки Drosophila, которые трудно изучать непосредственно.

Изображений Через куколки случае<em&gt; Дрозофилы</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

imaging-through-the-pupal-case-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

13.2K Views.  University of Miami.  Эта статья демонстрирует использование быстро сканирующей конфокальной микроскопии с поведением изображений клеток непосредственно через пупария. Задержите куколки дело нетронутыми, этот метод позволяет наблюдения и измерения динамических процессов кле...

Video: Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Вертикальная съемка Drosophila Эмбрионы

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Препарирование Oenocytes от взрослых Дрозофилы</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Изоляция Дрозофилы Семенники

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Дрозофилы куколки Живот Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Экс естественных Культура Drosophila куколки яичка и одного мужчины зародышевой линии кисты: Вскрытие, Imaging, и фармакологическому лечению

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Вскрытие и Монтаж<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколочные глаз Диски

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Поддержание<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Население Кейдж

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...