1. Обслуживание: Наблюдение культур под микроскопом <ol><li> Удаление одной пластине клеток из ЭСК 37 ° С инкубатор и довести до микроскопа. </li><li> Соблюдайте колоний при малой мощности, с помощью 2X или 5-кратным увеличением, чтобы оценить общее качество культуры. Обратите внимание на следующее: нормальный цвет среды, отсутствие какого-либо видимого загрязнения, общий размер колонии, качества и плотности, а любые другие соображения. </li><li> Соблюдайте среды изменяется цвет. В связи с изменением рН и истощение питательных веществ в среде после ночной инкубации с клетками ГЭС, среда изменится с красного оттенка, чтобы &quot;солома&quot; цвет. Если среда появляется фиолетовый, основной сдвиг рН произошло. Если среда представляется крайне желтый, подкисленной среде. Очень желтый среда может быть результатом чрезвычайно переполненных колоний в колодец или загрязнения. Среда должна отображаться яркое во все времена. Хотя определенный уровень клеточного мусора в среде нормально, это никогда не должно появляться облачность. Если высокий уровень клеточного мусора не наблюдается, культура не может считаться здоровым и может быть заражена. </li><li> Если культуры не требуют технического обслуживания или пассажи, они могут быть приняты для биологических кабинета безопасности, чтобы питаться (см. раздел 2). </li><li> Если культур содержат более 10% дифференциации колонии, клетки должны быть &quot;очищены&quot; от ручного удаления дифференцированы областях (см. раздел 3). </li><li> Если культур содержат большие или очень густые заросли, или слой MEF подачи составляет более 12 дней назад, клетки должны быть пассировать (см. раздел 4). </li></ol> 2. Кормление ЭСК клетки <ol><li> В стерильном кабинете биологической безопасности, удалите крышку культуры блюдо и аспирации провел среды. Не позволяйте кончика пипетки, чтобы касаться любой части пластины, кроме непосредственно внутри скважины. Если есть какие-либо озабоченности загрязнения, изменения в новую, стерильную пипетку. </li><li> Использование стерильной пипетки стекла, добавить соответствующее количество нагревается среду клеточной культуры ЭСК в каждую лунку. Для культур в 6-луночный планшет, добавить 2,5 мл среды на лунку. </li><li> Вернуться пластину инкубатор остаться при температуре 37 ° С и 5% СО 2. </li></ol> 3. Удаление из Дифференциация культур ЭСК сотовый <ol><li> Преобразование 9 дюймов стекло пипетки Пастера в выборе инструментов путем формовки перевернувшийся контролируемого пламени горелки алкоголя. Будьте уверены, что кончик пипетки запечатана, чтобы предотвратить заражение и закругленными, чтобы не поцарапать пластик культуры блюдо. Стерилизовать сбор инструменты перед использованием использованием УФ-источник света в кабинете биологической безопасности или собирание корпуса. </li><li> Удалить дифференцированных областей. Дифференциация часто происходит только часть колонии ЭСК клетки, как правило, по краям или в виде отдельных пятен в центре. Если бы только часть колонии дифференциации, только дифференцированные области должны быть удалены. Дифференциация может часто снимите пластину в &quot;липкие&quot; лист, и это полезно в первую очередь отдельных дифференцированных клеток от остальной колонии, рисуя линию через колонию с окончанием сбора инструмент. </li><li> Как только куски колонии разделены, мягко скользят выбора инструмента вдоль пластины отделить нежелательных клеток. Будьте осторожны, не соскрести слишком много слоев подачи MEF между колониями в этом процессе. </li><li> Когда все дифференцированные клетки удаляются из пластины (и плавающих в среде), возвращение культуры к биологическому кабинета безопасности. Аспирируйте среде, содержащей дифференцированные клетки и заменить свежей средой клеточной культуре ЭСК. </li></ol> 4. Пассирования ЭСК клетки Фермент Инкубационный <ol><li> В стерильном кабинете биологической безопасности, удалите крышку 6-и культуре блюдо и аспирации провел среды из скважин будет пассировать. Не позволяйте кончика пипетки, чтобы касаться любой части пластины, кроме непосредственно внутри скважины. </li><li> Использование стерильной пипетки стекло, добавляют 1 мл подогретой коллагеназы IV в каждую лунку быть пассировать. </li><li> Вернуться к пластине 37 ° C инкубатора в течение 5 минут. </li></ol> Зачистка и Объединение ЭСК клетки <ol start="4"><li> После инкубации клеток с коллагеназа, наблюдать колонии под микроскопом. Фермент должен вызывать тонкие, но заметные изменения в колонии края. </li><li> В биологическом кабинете безопасности, мягко аспирата фермента из каждой лунки и заменить 2,0 мл ЭСК культуральной среды клеток. </li><li> Совет культуры пластины немного к вам и занимают средний 2,0 мл в первой скважины с 5 мл стеклянные пипетки. Холдинг пипетку перпендикулярно к нижней части пластины, мягко скользить кончиком пипетки через хорошо, медленно выпуская среды. </li><li> Повторите выскабливание и pipettiнг движение 3-4 раза, пока все колонии были удалены из колодца. Внесите осторожно, чтобы не разбивая колоний в слишком мал штук. Когда клетки были удалены из первой скважины, оставьте содержания в хорошо и начать соскоб клетки от очередного хорошо. </li><li> Когда все скважины должны быть пассировали были Царапины, бассейн среде, содержащей колонии куски из каждой скважины в стерильные 15 мл коническую трубку. </li><li> Промыть Царапины скважин путем добавления 1 мл ГЭК среду клеточной культуры в каждую лунку. Сбор этого промыть и трансфер в конической трубе. </li><li> Внесите клетки мягко в трубке, чтобы разбить колонию весом до нужного размера. </li><li> Центрифуга клетки в течение 5 минут при 200 х г. </li></ol> Покрытие Клетки ЭСК сотовый <ol start="12"><li> Хотя ЭСК клетки находятся в центрифугу, подготовить новый 6-и MEF подачи пластины. Этикетка пластинки с соответствующей ячейке ЭСК информация: клеточная линия, новый номер прохода, и проход даты. Аспирируйте MEF среды из скважин и добавить 1,0 мл PBS в каждую лунку. Аккуратно водоворот буфер вокруг колодцев и аспирации мыть PBS. Добавить 1,5 мл клеточной культуре ЭСК среду в каждую лунку и установить пластину в сторону. </li><li> Когда ЭСК клетки закончил центрифугирования, довести трубку обратно в кабинет биологической безопасности. Аспирируйте супернатант, стараясь не мешать свободно упаковке осадок клеток. </li><li> Ресуспендируют клеток в гранулах с достаточным средством для 1 мл клеточной культуре ЭСК среды на хорошо, чтобы быть покрыты. При разделении на 6 новых скважин, ресуспендируют осадок в 6 мл среды. </li><li> Аккуратно и равномерно добавить 1 мл клеточной суспензии для каждого хорошо подготовились пластины подачи MEF. </li><li> Место пластинки в 37 ° C инкубатора и аккуратно вставьте пластину вперед-назад, и стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки во всем хорошо. </li><li> Разрешить клетки приложить при температуре 37 ° С в течение ночи. </li></ol> 5. Представитель Результаты: Недифференцированная клетках ЭСК маленькие, плотно упакованы, и обычно состоят из более крупных, более распространено клеток. Дифференциация может происходить в пределах колонии (рис. 1А) или между колониями (рис. 3В). Различные morhopologies можно увидеть под малом увеличении под микроскопом. Хорошая морфология клетки, как показано на рис 2А, содержит мелкие, плотно упакованных клеток, которые растут в монослой. Клетки должны иметь чистую, четкими краями, с практически нет дифференциации. Клетки показано на рис 2B готовы к пассажи, и клетки показано на рисунке 2C переполнены. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Дифференциация в культуре ЭСК. () Дифференциация колонии (Б) дифференциации между колониями. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Морфологии видел в культурах ГЭС. () Хорошая морфология клетки (B) ЭСК клетки, которые готовы к пассажей (C) переполненных камерах.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

Стерильность должна поддерживаться во все времена при работе с клетками ГЭС. Чистота и стерилизации биологических кабинета безопасности, и все оборудование перед использованием. Все реагенты должны быть отфильтрованы с помощью 0,22 мкм поры фильтра размером до использования. Использование antiboiotics в культуре клеток ЭСК не является необходимым и его следует избегать. Отдельная среда должна быть создана в качестве назначенного сбора станции. Стерильные корпуса для станции может быть статическим корпус (таких, как рабочая станция ПЦР) с УФ-источник света, капот ламинарного потока, или биологические кабинета безопасности. Рассекает микроскопом внутри сбор станции необходимо наблюдать колонии дифференцированных областей удаляются. Передняя панель из стекла статического корпус или кабинет биологической безопасности должны быть модифицированы, чтобы обеспечить окуляры микроскопа продлить через панель без ущерба для надлежащего потока воздуха и стерильность. Для поддержания здоровой клетки ЭСК культур, клетки должны быть пассировать в оптимальные сроки, как правило, каждые 4-7 дней. В это время в колонии достигли своего максимального размера и может быть началом для объединения. Объединенные колонии может увеличить скорость дифференциации в культуре. Сплит отношения как правило, делятся между 1:3 и 1:5, в зависимости от количества колоний покрытие, скорость расширения, и условия культивирования. Overplated колоний (Коэффициент распределения слишком низко), скорее всего, слияние преждевременно, и их необходимо пассировать не дожив до своего максимального размера. Культуры на слой MEF подачи, что составляет более 2 недель должны быть пассировать на новые MEFs, которые будут поддерживать недифференцированный рост и пролиферацию. С дифференциацией естественно происходит в культуре ЭСК клетки, небольшого количества не ожидается. Частое или чрезмерной дифференциации может произойти, если культуры не получают адекватной медицинской помощи. Клетки должны питаться каждый день, разрастание между переходы следует избегать. Всегда используйте свежие реагенты. Все средства массовой информации, MEFs и реагенты должны использоваться в течение 14 дней, чтобы избежать недифференцированные ЭСК клетка роста. Новый много реагентов, таких как нокаут сыворотки Замена, ФПС и MEFs, должны быть обследованы до начала использования. Помните, что все дифференцированные клетки не удаляются до пассажи будут переведены на новые культуры. Кроме того, старайтесь держать клетки при 37 ° С при любой возможности. Свернуть времени клетки проводят вне инкубатора (например, на столике микроскопа или в кабинете биологической безопасности.) Нагревательный столик микроскопа может быть очень полезно, если клетки будут инкубатора в течение длительных периодов времени. При наблюдении культур ЭСК клетки под микроскопом, сначала оценить общее качество и размер колоний просматривать с помощью малой мощности (2x или 5x) цели. Если потенциально дифференцированных клеток наблюдаются при малой мощности, подтвердите дифференцированной морфологии использованием большем увеличении цель (10X). Сразу же после удаления дифференциации, краев колонии могут появиться зубчатые или поврежден. Инкубируйте колоний на ночь в свежую среду, чтобы оставшиеся недифференцированные клетки для восстановления. Без влияния дифференциации в культуре, эти оставшиеся колонии будут продолжать размножаться в обычном режиме. Если это возможно, начать эксперименты с использованием низких прохождения ЭСК клетки. Кариотип клетки до и после всех основных экспериментов.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

Человека эмбриональных стволовых (ЭСК) клетки должны контролироваться и заботу, чтобы поддерживать здоровый, недифференцированной культуры. Как минимум, культуры надо кормить каждый день, выполняя полное изменение среды для пополнения потерянные питательные вещества и поддерживать культуру свободного от нежелательных факторов дифференциации. Хотя небольшое количество дифференциации нормального и ожидаемого в культурах стволовых клеток, культура должна быть регулярной очистке с помощью ручного удаления или &quot;собирание&quot; дифференцированных областей. Выявление и устранение избыточного отличия от культуры ЭСК ячейки необходимы методы в поддержании здоровой популяции клеток.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Этот протокол свидетельствует о том, как сохранить здоровыми, недифференцированные человеческие эмбриональные стволовые (ЭС) клеток.

Культура и поддержание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

culture-and-maintenance-of-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

47.5K Views.  Stemgent. Этот протокол свидетельствует о том, как сохранить здоровыми, недифференцированные человеческие эмбриональные стволовые (ЭС) клеток.

Video: Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Распространение человеческих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Вывод человеческих эмбриональных стволовых клеток на применение специфических иммунных сывороток в хирургии

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

В пробирке Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток для магнитно-резонансная томография

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Хромосомные Подготовка распространения человеческих эмбриональных стволовых клеток для Кариотипирование

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Замораживание и размораживание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Взрослые и эмбриональные скелетных мышц Microexplant культуры и выделение скелетных мышц стволовых клеток

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...