Клеточный цикл quiescence является ключевой особенностью гематопоэтических стволовых клеток. Этот протокол помогает понять поведение тихие человеческие HSCs in vitro вблизи физиологических условий. Используя этот протокол, исследователи могут проверить влияние различных соединений, питательных веществ или белков, которые регулируют состояние клеточного цикла, а также дифференциацию ГКС в масштабируемой манере без использования моделей животных.
Противоопухоляющие препараты имеют различное влияние на выживание тихие HSCs и велосипедных прародителей. Этот протокол позволяет найти агенты, которые щадят тихие HSCs или агентов, которые избирательно повреждения тихие лейкемические стволовые клетки. Демонстрацией процедуры будет Хироси Кобаяси, старший научный сотрудник лаборатории Такубо.
Для начала растворите 16 миллиграммов на миллилитр натрия пальмитата, 30 миллиграммов на миллилитр олеата натрия и четыре миллиграмма на миллилитр холестерина в метаноле в стеклянных трубках. Храните липидные растворы при отрицательном 30 градусов по Цельсию и оттаивать их перед использованием. В свежей стеклянной трубке смешайте липидные растворы, чтобы получить окончательную концентрацию 100 микрограммов на миллилитр пальмитата, 100 микрограммов на миллилитр олеата и 20 микрограмм на миллилитр холестерина.
Испарить метанол, передав азотный газ через липидный раствор. Полностью испарить оставшийся метанол, нагревая стеклянную трубку в водяной бане при 37 градусах цельсия. Подготовка DMEM/F-12 среды с HEPES и глутамин.
Добавьте пенициллин и стрептомицин сульфат для окончательной концентрации 50 единиц и 50 микрограмм на миллилитр соответственно. Среда может храниться при четырех градусах по Цельсию в течение не менее двух месяцев. Добавьте 4% BSA в среду DMEM/F-12 с HEPES и глутамином, затем отрегулируйте рН среднего до 7,6 с использованием гидроксида натрия.
Добавьте среду в стеклянную трубку с липидами. Полностью растворите липиды с помощью звуковой данных. Если среда непрозрачна после звукового око, продлите время звукового окония.
Когда BSA и липиды растворяются, образцы должны храниться при отрицательном 80 градусов по Цельсию и использоваться в течение двух месяцев. Добавьте 0,001X инсулина, трансферрина, натрия населита и этанола амина смеси DMEM/F-12, а затем фильтровать смешанную среду с помощью 0,22 микрометрового фильтра. Перед использованием добавьте фактор стволовых клеток человека или СКФ и тромбопоэтин человека или ТПО в культурные средства массовой информации при конечной концентрации в три нанограмма на миллилитр каждый.
Перенесите 200 микролитров ранее подготовленных культурных медиа с цитокинами на плоские нижние 96-колодецные пластины. Чтобы избежать испарения среды, заполните все неиспользованные скважины 100-200 микролитров PBS. Resuspend отсортированы гематопоэтические стволовые клетки или HSCs в культурных средствах массовой информации без цитокинов на 60 клеток на микролитер.
Aliquot 600 клеток в каждой хорошо. Менее 300 клеток приведет к более крупным техническим изменениям и культивирования более 1000 клеток в одном колодец следует избегать из-за лишения питательных веществ или накопления неблагоприятных цитокинов или хемокиных. Культура клеток в увлажненной многоясной инкубатор при 37 градусах цельсия в 5%углекислого газа и 1%кислородной атмосфере.
После семи дней культивирования очищенных ГКС, до 80% клеток отображаются маркер CD34 положительные и CD38 отрицательных фенотипов. Общее количество клеток зависело от концентрации цитокинов. Более высокие концентрации СКФ и ТПО индуцируют вступление в клеточный цикл, пролиферацию и дифференциацию.
Количество фенотипических ГХК, характеризующихся маркером CD34 положительные, CD38 отрицательные, CD90 положительные и CD45 RA отрицательные фенотипы увеличились пропорционально концентрации SCF или TPO в то время как частота среди общих клеток снизилась. После трех месяцев трансплантации культурных взрослых ВКС костного мозга, восстановление может быть оценено как функция их частоты в периферической крови человека CD45 положительный мурин, CD45 отрицательных Тер119 отрицательных клеток. Три линии, включая CD19 положительные В-клетки, CD13 отрицательный, CD33 положительные миелоидные клетки, и CD3 положительные Т-клетки были восстановлены в NOG мышей пересажены либо только что оттаяли или культурных HSCs.
Следуя культуре, ГКС могут подвергаться профилированию экспрессии генов, таким как ПЦР в реальном времени и секвенирование РНК. Функциональная проверка с использованием трансплантации в иммунной дефицит мышей также может быть выполнена. Исследователи могут напрямую сравнить велосипедные и тихие HSCs в определенных условиях путем корректировки концентраций цитокинов.
Это поможет понять, что такое тихие программы самообувещения HSC, механизмы стрессоустойчивости и метаболические свойства, которые трудно проверить в настройках vivo.
