Как только на седьмой день будет получено около 25 миллионов донорских клеток митохондрий, соберите экспоненциально выращенные клетки в 50-миллилитровую пробирку и соберите их центрифугированием при комнатной температуре и 520 г в течение пяти минут. Промойте клетки холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором и осаждайте их центрифугированием при комнатной температуре 520 г в течение пяти минут. Теперь выполните всю митохондриальную экстракцию при четырех градусах Цельсия с использованием холодных реагентов и держите клетки или митохондрии на льду.
После третьего центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости путем аспирации с помощью стеклянной пипетки, соединенной с вакуумным насосом, и ресуспендируйте упакованные клетки в объеме гипотонического буфера, равном семикратному объему клеточных гранул. Затем перенесите клеточную суспензию в пробирку гомогенизатора и дайте клеткам набухнуть, инкубируя их на льду в течение двух минут. Разорвите клеточные мембраны, выполнив от 8 до 10 ударов в гомогенизаторе, соединенном с пестиком с моторным приводом, вращающимся со скоростью 600 оборотов в минуту.
В гомогенат клетки добавляют гипотонический буфер, в семь раз превышающий объем исходной гранулы, для создания изотонической среды. Перелейте гомогенат в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте его в фиксированном роторе при температуре 1 000 г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем собирают только 3/4 надосадочной жидкости, оставляя большой запас от гранулы, чтобы избежать загрязнения ядрами или неповрежденными клетками и переносят ее в другую пробирку.
Повторив процесс дважды, перенесите надосадочную жидкость, содержащую митохондриальную фракцию, в 1,5-миллилитровые пробирки. Центрифугируйте пробирки с максимальной скоростью 18 000 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте обогащенную митохондриями гранулу буфером А. Объедините содержимое двух пробирок в одну и центрифугу, как показано ранее.
Повторяйте процесс до тех пор, пока весь материал не окажется только в одной трубке. Промойте гранулы, полученные в результате последнего центрифугирования, используя 300 микролитров буфера A. Количественно определите концентрацию митохондриального белка с помощью анализа Брэдфорда. Перед слиянием с клеточной линией митохондрий-реципиентов оцените отсутствие контаминантов ядер в митохондриальной фракции путем иммунодетекции ядерных белков.
В качестве альтернативы проводят количественную полимеразную цепную реакцию или КПЦР-амплификацию ядерного гена.
