Для генерации трансмитохондриальных цибридов используйте митохондриальные клетки-реципиенты, которые были истощены до митохондрий обработкой родамином 6G, и выполните слияние с митохондриями, выделенными из донорских клеток митохондрий. Обеспечьте надлежащую отмену митохондриальной функции в клетках-реципиентах и очистку органелл от донорских клеток путем посева небольшого количества клеток, обработанных родамином 6G, и изолированных митохондрий в полную питательную среду в шестилуночную пластину. Проверьте, не осталось ли выживших клеток в лунках после одного месяца культивирования.
Чтобы продолжить слияние, осторожно добавьте клетки, обработанные родамином 6G, в изолированную гранулу митохондрий. Затем центрифугу при 520 г в течение пяти минут, чтобы клетки могли смешаться с митохондриями. Добавьте 100 микролитров 50% полиэтиленгликоля и осторожно ресуспендируйте гранулу в течение 30 секунд Затем оставьте суспензию нетронутой еще на 30 секунд.
Наконец, переложите смесь в шестилуночную тарелку со свежей полной средой для культивирования клеток и поместите ее в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Обычно примерно через неделю трансмитохондриальные цибриды начинают расти, давая начало клонам, которые могут быть индивидуально отобраны или смешаны в пуле перед их анализом. Фрагменты рестрикции, полученные в результате анализа полиморфизма длины рестрикционного фрагмента, или RFLP, митохондрий дикого типа, отличались от мутантного.
Анализ RFLP новых трансмитохондриальных клеточных линий показал, что фрагменты рестрикции были идентичны фрагментам, полученным в соответствующих митохондриальных донорах, и отличались от фрагментов, полученных с помощью клеточных линий-реципиентов. Кроме того, разница в типичном профиле ядерного генотипирования ДНК двух клеточных линий, используемых в процессе гибридизации, также может быть использована для подтверждения чистоты ядерной ДНК.
