Для начала возьмите синхронизированных молодых взрослых гермафродитов C.elegans в микроцентрифужной пробирке. Добавьте 200 микролитров буфера M9, содержащего Poloxamer 188, Pluronic F127, и два микролитра реагента для окрашивания набора в гранулу червяка. Накройте тюбики алюминиевой фольгой, чтобы защитить красители от света.
Дайте смеси вращаться при 20 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре. Затем раскрутите червей при 500 г в течение одной минуты. После этого удалите окрашивающий раствор, не нарушая гранулы червяка.
Трижды промойте червей буфером M9 и переложите их в пластину с агаром NGM с семенами, содержащую соответствующую обработку. Смойте червей с пластин в свежие микроцентрифужные пробирки с одним миллилитром буфера M9. После этого зафиксируйте червей 1%-ным формальдегидом на льду на 30 минут.
И трижды промойте червей одним миллилитром буфера M9, чтобы удалить остатки формальдегида. После гранулирования червей аспирируйте максимальное количество надосадочной жидкости, сохраняя гранулу неповрежденной в 10 микролитрах М9. Затем, чтобы приготовить 2,5% агарозы, взвесьте 0,125 грамма агарозы в 10-миллилитровую пробирку из боросиликатного стекла. Добавьте пять миллилитров буфера М9 и растворите агарозу, осторожно нагрев трубку горелкой Бунзена.
Переложите растопленную агарозу в сухую ванну, установленную при температуре 75 градусов Цельсия. Добавьте 100 микролитров расплавленной агарозы на покровное стекло микроскопа с помощью одномиллилитрового наконечника. Сразу же положите еще одно предметное стекло перпендикулярно на каплю агарозы, образуя крестообразную форму.
Через две минуты аккуратно отделите предметные стекла, нажав на верхнее стекло крышки, оставив агарозную подушку на нижней крышке. Перенесите червей на агарозную подушечку с помощью стеклянной пипетки Пастера. Используйте фитиль, сделанный из лабораторной салфетки, чтобы удалить лишнюю жидкость.
Затем накройте червей меньшим покровным стеклом и нанесите прозрачный лак для ногтей на периферию, чтобы предотвратить испарение. Поместите предметное стекло в темную коробку, чтобы защитить его от света. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации червей в течение 24 часов на соответствующих длинах волн с использованием линзы с 60-кратным увеличением.
Затем откройте программное обеспечение для обработки изображений и щелкните правой кнопкой мыши серую область. В появившемся всплывающем окне выберите приобретение. Полная прокладка Ti2.
Получение нейтральных данных и таблицы подстановки. В разделе Ti2 full pad выберите 60 раз и отрегулируйте ручку точной фокусировки микроскопа, чтобы сфокусировать червей. Затем выберите вращающийся диск и выберите опцию 16-битного биннинга.
Для каждого флуоресцентного фильтра установите время экспозиции на 500 миллисекунд и 20 миллисекунд для яркого поля. После того, как эти параметры установлены, выберите «Запустить сейчас» и подождите, пока выходное изображение будет сгенерировано в виде файла ND2.
