После визуализации обработанного препаратом C.elegane откройте файл ND на сервере образа J с помощью плагина колокализации и выберите параметр разделения изображений в диалоговом окне. Каждый файл ND содержит плоскости изображения, снятые на трех длинах волн и в видимом свете. Работайте с яркими полями, зелеными и красными изображениями.
Создайте дубликаты этих изображений, чтобы сохранить исходное изображение нетронутым, щелкнув изображение и выбрав «Дублировать» или используя сочетание клавиш, сдвиг плюс D. Затем уменьшите фон, создав еще один дубликат изображения, как показано ранее. Вычтите фон с радиусом прокрутки 100 и выберите параметр «Создать фон», чтобы создать изображение с фоном данного изображения. Теперь перейдите к обработке, нажмите калькулятор изображений и вычтите первое дублированное изображение из второго дублированного изображения.
Используйте полученные изображения для анализа колокализации. Чтобы использовать плагин колокализации, преобразуйте изображения зеленого и красного каналов в восьмибитные, щелкнув изображение, выбрав тип, а затем восемь бит. Затем нажмите на плагины и выберите колокализацию.
Чтобы измерить колокализацию сигналов митохондрий и лизосом, установите соотношение 75%, пороговый красный канал — 80,0, а пороговый зеленый канал — 50,0. На выходе генерируется восьмибитное двоичное изображение, содержащее колокализованные точки и объединяющее три восьмибитных изображения в RGB-изображении. Затем сосредоточьтесь на точках в мышцах стенки головы червей, вручную выделив область и создав маску, нажав «Изменить», «Выделить» и «Создать маску», чтобы выбрать интересующую область.
Чтобы выбрать частицы в интересующей области, используйте калькулятор изображений, чтобы выбрать колокализованные восьмибитные и замаскированные изображения. Используйте операцию и выберите пункту в интересующей области, создав изображение с пунктой в интересующей области. Наконец, чтобы проанализировать площадь колокализованных митохондрий и лизосом, выберите «Анализ», затем «Проанализировать частицы» и измерить сумму точек между 0,1625 квадратных микрометра и четырьмя квадратными микрометрами.
Конфокальные изображения мышц стенки головы червей показали колокализацию митохондрий и лизосом. VL-850 индуцировал сильную митофагию в мышцах стенки тела головы червя, что указывает на мощный индуктор митофагии. Эффективность митофагии VL-850 была аналогична таковой FCCP.
