После визуализации обработанных препаратом клеток Hep-3B откройте конфокальные изображения на изображении J с помощью плагина колокализации. Откройте ND-файл на J-сервере образа и выберите опцию разделения каналов в диалоговом окне. Работайте с зелеными и красными изображениями.
Создайте дубликаты этих изображений, чтобы сохранить исходное изображение нетронутым, щелкнув изображение и выбрав «Дублировать» или используя сочетание клавиш Shift плюс D.To уменьшить фон, создать еще один дубликат изображения, вычесть фон с радиусом прокрутки 100 и выбрать параметр «Создать фон», чтобы создать изображение с заданным фоном изображения. Затем перейдите к обработке. Нажмите «Калькулятор изображений» и вычтите первое дублированное изображение из второго дублированного изображения.
Используйте полученные изображения для анализа колокализации. Чтобы использовать плагин колокализации, преобразуйте изображения зеленого и красного каналов в 8-битные, щелкнув изображение, выбрав тип, а затем 8 бит. Затем нажмите на плагины и выберите колокализацию.
Чтобы измерить колокализацию сигналов митохондрий и лизосом, установите соотношение 75%, пороговый красный канал — 80,0, а пороговый зеленый канал — 50,0. Будет сгенерировано 8-битное двоичное изображение, содержащее колокализованные точки и объединяющее три 8-битных изображения в RGB-изображение. Преобразуйте эти изображения в 8-битные изображения.
Чтобы получить интересующую область ячеек, создайте изображение, которое выделяет область ячеек, выбрав изображение колокализованной точки. Чтобы выделить всю область ячейки, выберите результирующее изображение колокализованных точек и нажмите на изображение, отрегулируйте порог и установите порог, чтобы убедиться, что вся область ячейки выделена. Чтобы проанализировать площадь ячейки, выберите «Анализ», нажмите «Анализировать частицы» и измерьте все частицы на изображении от нуля до бесконечности, что является параметром по умолчанию для анализа частиц.
Чтобы проанализировать площадь колокализованных митохондрий и лизосом, выберите колокализованное 8-битное изображение. Затем выберите «Анализировать». Нажмите «Анализ частиц» и измерьте сумму точек в диапазоне от 0,1625 квадратных микрометра до четырех квадратных микрометров.
Разделите площадь колокализованных митохондрий и лизосом на общую площадь клеток, чтобы измерить колокализованную пункту. Конфокальные изображения клеток Hep-3B показали колокализацию митохондрий и лизосом. VL 850 и FCCP индуцировали значительную митофагию в клетках Hep-3B.
