Для начала введите Limosilactobacillus reuteri DSM20016 из запасов глицерина в шесть миллилитров бульона De Man, Rogosa, Sharpe или MRS в 50-миллилитровой пробирке. Инкубируйте культуру аэробным способом в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в статическом инкубаторе. На следующий день введите четыре миллилитра ночной культуры в 200 миллилитров бульона MRS.
Дайте культуре расти аэробно в статическом инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока оптическая плотность на 600 нанометрах не достигнет от 0,5 до 0,85. Затем сцедите культуру в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров и поместите их на лед, одновременно балансируя пробирки. Центрифугируйте культуру в предварительно охлажденной центрифуге и выбросьте надосадочную жидкость.
Перед тем, как снова суспендировать гранулу в 50 миллилитрах предварительно охлажденной воды двойной дистилляции, повторите центрифугирование два раза. После последнего центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 25 миллилитрах дважды дистиллированной воды, 0,5 молярной сахарозы и 10% глицерина. Центрифугируйте клеточную суспензию, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах двойной дистиллированной воды, 0,5 молярной сахарозы и 10% глицерина на льду.
Разложите суспензию на порции от 50 до 100 микролитров в предварительно охлажденных микроцентрифужных пробирках и храните пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего использования. Далее для электропорации разморозьте аликвоту электрокомпетентных ячеек на льду. Смешайте от пяти до 10 микролитров плазмиды с размороженной аликвотой, избегая пипетирования, насколько это возможно.
Переложите смесь в охлажденную льдом электропорационную кювету с зазором в один миллилитр и электропорируйте при напряжении 1,25 киловольта, 400 Ом и 25 микрофарадах. После электропорации добавьте один миллилитр бульона MRS и перемешайте, перевернув кювету один или два раза. Поместите кюветы в статический инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 2,5-3 часа для восстановления.
Затем наложите всю суспензию на несколько пластин шнека MRS с соответствующим выбором. Поместите тарелки в герметичный контейнер с маленькой зажженной свечой в пакетик, генерирующий анаэробную атмосферу. Выращивайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех дней или до появления видимых колоний.
Электропорация L.reuteri с конститутивным mCherry2, продуцирующим плазмиду pTRKH3, дает эффективность трансформации примерно от пяти до восьми колоний на 200 микролитров покрытия, независимо от условий метилирования плазмиды. Трансформация с pNZ123, не несущим экзогенного конститутивного репортерного белка, привела к эффективности трансформации в три раза по 10 к четырем КОЕ на микрограмм ДНК.
