Для начала выключите свет в комнате. Выберите «Окуляр» под панелью «Окуляр» в программном обеспечении FlowView. Измените кубическую турель на четыре TRITC и выключите контроллер сенсорной панели, щелкнув по нему под подсветкой контроллера сенсорной панели в программном обеспечении.
Затем выключите экран компьютера. Откройте на микроскопе лицевую сторону крышки из черной ткани. Возьмите 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном, содержащую эмбрионы из черного ящика, и поместите ее на предметный столик микроскопа.
Затем включите блок флуоресцентного освещения, и с помощью окуляра определите интересующий эмбрион. Сосредоточьтесь на этом. Закройте черную тканевую крышку, чтобы защитить образец от света.
Включите экран компьютера, чтобы получить доступ к программному обеспечению, управляющему микроскопом. Измените окуляр на LSM в программном обеспечении для получения изображения. Проведите лазерную абляцию у контрольных нестимулированных эмбрионов с использованием объектива для погружения в воду с 25-кратным увеличением.
Нажмите «Bright Z», «Диспетчер последовательностей» и «Стимуляция LSM» в окне инструментов. Установите тип сканера как Galvano, а размер сканирования — 512 на 512. Включите первый и третий каналы под панелью настроек PMT, чтобы разрешить использование лазера с яркостью 1040 нанометров, и нажмите в прямом эфире с четырехкратной скоростью, чтобы визуализировать эмбрион.
Поверните эмбрион с помощью функции вращения, чтобы сделать переднюю заднюю ось вертикально ориентированной, и установите масштаб на три. Нарисуйте область интереса или ROI с помощью инструмента «Фигура» в разделе «Параметры сканирования» и установите размер ROI на справочной панели. Затем установите ROI как 512 пикселей в ширину и 100 пикселей в высоту.
Чтобы задать параметры сбора данных для Z-стека перед абляцией, зарегистрируйте поверхность эмбриона как ноль в разделе Z. Установите начало как ноль, а конец как 100 микрометров. Установите размер шага в два микрометра и активируйте режим сбора Z, установив флажок Z на вкладке серий.
Используя яркую функцию Z, установите интенсивность лазера 1040 нанометров, чтобы она линейно увеличивалась от 3% до 7%Сохраните текущую настройку визуализации в качестве первой задачи конвейера, нажав LSM в диспетчере последовательностей. Чтобы задать параметры съемки для видеоролика перед абляцией, установите ROI 512 на 512 пикселей вблизи вентральной поверхности эмбриона, как было показано ранее. Установите интенсивность лазера 1 040 нанометров на 3%Проверьте время и снимите флажок Z под панелью последовательности.
Оставьте интервал как «Свободный ход» под панелью замедленной съемки и установите цикл равным 10. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в Диспетчере последовательностей. Чтобы задать параметры для лазерной абляции, определите 3D-область непосредственно под мембраной vitelline.
Установите начало стека Z в качестве плоскости, а конец на 20 микрометров глубже. Установите размер шага 1,5 микрометра. Включите второй и четвертый каналы под панелью настроек PMT, чтобы разрешить использование лазера с яркостью 920 нанометров.
Установите интенсивность лазера на 30% и установите получение изображения с помощью лазера для одного стека Z в определенной 3D-области. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в Диспетчере последовательностей. Чтобы задать параметры сбора данных для видеоролика после абляции, задайте захват изображения для видеоролика после абляции с разрешением 100 кадров в одиночной плоскости Z с использованием лазеров 1, 040 и 920 нанометров.
Установите интенсивность лазеров на 3% и 0,3%Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, нажав LSM в Диспетчере последовательностей. Выберите последовательность в разделе Получение. При необходимости измените путь сохранения данных и имя файла.
Нажмите кнопку «Готово» и подождите, пока программное обеспечение инициализирует конвейер, затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы выполнить конвейер. Для проведения лазерной абляции у стимулированных эмбрионов установите параметры сбора данных для Z-стека перед абляцией, как показано для нестимулированных эмбрионов. Сохраните текущую настройку в качестве первой задачи конвейера, щелкнув LSM в Диспетчере последовательностей.
Чтобы задать параметры оптогенетической стимуляции в пределах определенного ROI, измените масштаб на единицу и выберите ROI, который охватывает вентральную поверхность эмбриона. Выключите детекторы с первого на четвертый канал, нажмите LSM-стимуляцию, снимите флажок непрерывно в течение длительности и введите 12 секунд. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, нажав «Стимуляция» в Диспетчере последовательностей.
Установите трехминутное время ожидания после стимуляции, чтобы обеспечить полную инактивацию миозина и апикальную разборку F-актина и достичь статической морфологии ткани перед лазерной абляцией. Затем задайте параметры сбора данных для фильма, снятого перед абляцией в одиночной плоскости Z, как показано для нестимулированных эмбрионов, за исключением того, что для получения изображения используются лазеры размером 1, 040 и 920 нанометров. Включите первый канал до четвертого канала детекторов.
Установите интенсивность лазеров на 3% и 0,3%Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, нажав LSM в Диспетчере последовательностей. Установите параметры для лазерной абляции, как показано для нестимулированных эмбрионов. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в Диспетчере последовательностей.
Установите параметры сбора данных для постабляционного фильма в одиночной плоскости Z, как показано для нестимулированных эмбрионов. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в Диспетчере последовательностей. Выберите последовательность в разделе Получение.
При необходимости измените путь сохранения данных и имя файла. Нажмите кнопку «Готово» и подождите, пока программное обеспечение инициализирует конвейер, затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить конвейер. У нестимулированных эмбрионов, подвергшихся апикальной констрикции, макаронная тыква mCherry обогащалась в медиальной апикальной области, в то время как CRY2Rho с одним доминантным отрицательным mCherry был цитозольным.
У стимулированных эмбрионов доминантный негативный сигнал mCherry CRY2Rho стал локализованным на плазматической мембране, в то время как медиальный апикальный сигнал спагетти mCherry полностью исчез. Лазерная абляция нестимулированных эмбрионов в области сужения приводила к быстрому откату тканей вдоль передней задней оси, в то время как лазерная абляция у стимулированных эмбрионов не приводила к заметному откату тканей. Абляция была количественно оценена и показана здесь.
