Начните с измерения концентрации кардиомиоцитов желудочков крыс у новорожденных с помощью гемоцитометра. Раствор клеточной суспензии разбавить до 3000 клеток на миллилитр альфа-МЭМ, содержащим 10% инактивированного теплом FBS. Распределите 100 микролитров разведенного желудочкового кардиомиоцита в каждой лунке неадгезивных 96-луночных пластин клетки.
Центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 100 G. Культивируйте их в течение двух-трех дней в инкубаторе для клеточных культур с 5% углекислым газом при 37 градусах Цельсия. После инкубации аспирируйте питательную среду из шариков кардиомиоцитов крысы, посеянных в неадгезивную 96-луночную пластину. Затем переложите кардиомиоцитарные шарики из каждой лунки в 15-миллилитровую трубку.
Центрифугируйте кардиомиоцитарные шарики и аспирируйте надосадочную жидкость. Затем промойте их с помощью буфера ADS. Чтобы облегчить отслеживание кардиомиоцитарных клеток у крысы после приживления, окрашивайте клетки PKH26.
Перед центрифугированием клеток отслеживайте развитие шариков кардиомиоцитов бидима, регулярно наблюдая за ними под микроскопом после посева. Начните подготовку основного инъекционного аппарата для инъекции неонатального кардиомиоцитарного шарика с помощью иглы 29 калибра длиной 50 миллиметров, оснащенной шприцем. Подсоедините иглу шприца 18 калибра объемом один миллилитр к тонкой полипропиленовой трубке с низкой расширяемостью просвета.
Вдохните воду с помощью шприца, и удалите все пузырьки из шприца и подключенных трубок. Повторите то же самое для другой иглы 18 калибра. Затем подсоедините другую сторону передающей трубки к игле 18 калибра того же одномиллилитрового шприца.
Подтвердите успешный переход мощности, нажав на один поршень шприца вниз, а другой поршень шприца вверх. Как только это будет сделано, установите шприц в шприцевую помпу. Затем настройте систему охлаждения, прикрепив плотно закрученную медную трубку к ячейке, содержащей часть шприца для инъекций клетки.
Оставляем по 10 миллиметров лишней трубы на обоих концах. Подсоедините медную трубку к гибкой пластиковой трубке, прежде чем подключать другие концы пластиковой трубки к внешнему насосу. Заполните линию охлаждающей водой и погрузите излишки медной трубки в колотый лед, чтобы охладить воду.
Эта система охлаждения поддерживает температуру суспензии ячеек в цилиндре на уровне примерно 2 градусов Цельсия.
