Чтобы окрасить мембрану везикулы, добавьте флуоресцентный липидный краситель FM4-64 в очищенные пузырьки в конечной концентрации два микромоляра и инкубируйте в течение 10 минут перед визуализацией. После выделения заполненных белком везикул из культуры Escherichia coli, нанесите очищенные везикулы пипеткой на круглую круглую прокладку размером менее одного миллиметра из агарозы толщиной менее одного миллиметра, которой дали сформироваться, и закрепите ее на чистом предметном стекле. Как только жидкость высохнет, наденьте крышку размером 50 на 25 миллиметров на везикулы на прокладке.
Удерживайте крышку на месте с помощью распорок и клейкой ленты. Затем установите предметное стекло на перевернутый микроскоп с помощью масляного иммерсионного объектива и оставьте образец на две-три минуты, чтобы он остыл и температура стабилизировалась. Для изображений с одним кадром используйте усреднение по трем изображениям, чтобы уменьшить зависящий от оборудования случайный фоновый шум.
Для цейтраферной съемки делайте интервал между отдельными кадрами от трех до пяти минут. Широкопольная флуоресцентная микроскопия показала очищенный зеленый амнион, содержащий везикулы. Липофильный флуоресцентный краситель FM4-64 подтвердил наличие мембран везикул.
Структурированная световая микроскопия живых бактериальных клеток, экспрессирующих белок внутренней мембраны, CydB, слитый с зеленым амнионом, и VNp6-mCherry2, показала образование везикул и введение груза.
