Высвободите хроматиновые кольцевые комплексы lexA CBP из магнитных шариков, используемых для очистки локуса гена хроматина с одной копией, путем инкубации пчел с двумя микролитрами меченного 6xHis рекомбинантного вируса травления табака или протеазы TEV. После отделения пчел от конечного элюата с помощью магнитной решетчатой пересадки элюат, содержащий хроматиновые кольца, расщепляется в новую реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Снова поместите пробирки на магнитную решетку, чтобы отделить остатки гранул от конечного элюата.
Повторно суспендируйте шарики в 750 микролитрах холодного буфера из карбоната аммония перед хранением некоторых образцов при температуре 20 градусов Цельсия для анализа ДНК и белков. Из окончательного элюата выньте образцы и храните их при температуре 20 градусов Цельсия для анализа ДНК и белков. Далее берут пробы из остатков бусин.
Начните денатурационное элюирование с двукратной промывки магнитных шариков в 750 микролитрах холодного буфера из карбоната аммония в течение 20 минут каждая, четыре градуса Цельсия, вращаясь со скоростью 20 оборотов в минуту. Далее добавьте в гранулы 500 микролитров 0,5 молярного гидроксида аммония для извлечения связанных комплексов хроматина lexA и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Отделите шарики от суспензии с помощью магнитного штатива и перенесите элюат в реакционную пробирку с низким уровнем связывания.
Инкубируйте реакционную пробирку с низким связыванием при комнатной температуре в течение 30 минут и отделите шарики от суспензии с помощью магнитного штатива. Как только это будет сделано, переложите элюат в реакционную пробирку с низким связыванием. Ресуспендируйте шарики в 750 микролитрах деионизированной воды и соберите образцы для анализа ДНК и белков.
Наконец, получите образцы анализа ДНК и белка из конечного элюата. В исследовании эффективность очистки локуса ARS316 и рекомбинационного штамма была количественно оценена и сравнена с контрольным локусом PDC1. Локус ARS316 показал более низкое восстановление протока по сравнению с PDC1.
Несмотря на то, что часть хроматиновых колец оставалась связанной с шариками TEV из-за неполного расщепления протеазы TEV, элюирование денатурации приводило к восстановлению локуса ARS316 на 80-90%. Это соответствует высокому обогащению молекул ARS316 в гранулах TEV и фракциях элюирования денатурации при учете размера генома дрожжей по сравнению с контрольным штаммом, который не показал обогащения локуса ARS316 ни в одной из количественных фракций. После элюирования TEV гранулы показали более высокий процент восстановления локуса ARS316, поскольку эффективность расщепления TEV не была 100%. Это привело к тому, что фракция хроматиновых колец осталась связанной с бусинами.
Тем не менее, ускользание от денатурации показало от 80 до 90% восстановления локуса ARS316 и рекомбинационного штамма, соответствующего высокому обогащению молекул ARS316 при учете размера генома дрожжей.
