Начните с помещения рассеченных коленных суставов мыши в чашку для культивирования. Отсадите питательную среду и добавьте свежую питательную среду. Повторите стирку три или четыре раза.
Затем под стереомикроскопом вывихните все стыки в питательной среде, вытянув их с помощью тонкого пинцета. Удалите большеберцовую кость и как можно больше сосудов, сухожилий и связок, стараясь не сломать кости. Подготовьте две пробирки по 15 миллилитров на пробу.
С помощью пинцета перенесите вывихнутые кости с мягкими тканями в первую трубку. Для каждого образца, полученного с обеих задних лап, добавьте в пробирку четыре миллилитра пищеварительной среды. Для сбора остаточных клеток и фрагментов тканей переносят питательную среду из вскрытия во вторую 15-миллилитровую пробирку.
Центрифугируйте среду при 500 G в течение 5 минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу одним миллилитром метандистановой среды. И переложите этот раствор в первую 15 миллилитровую трубку так, чтобы в ней содержалась почти вся ткань, всего пять миллилитров пищеварительной среды.
Затем переваривайте образец в течение 60-120 минут при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в гибридизационной печи. После инкубации перемешайте образец с помощью пипетирования и отфильтруйте клеточный раствор через сетчатый фильтр для клеток 40 микрон в пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте в пробирку через клеточное ситечко 10 миллилитров питательной среды.
Центрифугируйте при 300 G в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 10 миллилитрами питательной среды. Повторите центрифугирование, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу двумя миллилитрами питательной среды.
