Прежде чем начать, проведите выделение синовиальных фибробластов и используйте в этой процедуре неадгезивные клетки, собранные из чашки, покрытой коллагеном. Высадите неадгезивные клетки на посуду размером от 40 до 60 миллиметров, которая не была покрыта коллагеном. Культивируйте объемные клетки в течение одного дня при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% углекислым газом.
Чтобы удалить неадгезивные лимфоциты, аспирируйте культивируемую среду, а затем добавьте свежую питательную среду. Культивируйте адгезивные объемные клетки в течение одной-двух недель со сменой среды каждые два дня, сохраняя при этом конфлюенцию. Затем постирайте два раза PBS или HBSS.
Выберите синовиальные макрофаги, обработав их 0,05% трипсином в HBSS, и инкубируйте в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% углекислым газом. Затем аккуратно добавьте питательную среду до 0,05% трипсина в HBSS. После этого шага не стоит выливать среду непосредственно на клетки.
Чтобы удалить оторвавшиеся клетки, аспирируйте культивируемую среду, а затем осторожно добавьте свежую питательную среду. Повторите два или три раза и сохраните клетки на чашке в свежей питательной среде до использования. Макрофагоподобные клетки были выделены у самок мышей C57BL/6 в возрасте от 7 до 8 недель и проанализированы с помощью ОТ-кПЦР.
Экспрессия мРНК пан-макрофагальных маркеров CD68, EMR1, ITGAM, CSF1R показала богатую макрофагами изоляцию из ткани синовита. Для установления чистоты макрофагов методом проточной цитометрии были проанализированы маркеры поверхностных белков для макрофагов и других типов клеток. Более 90% клеток экспрессировали макрофагальные маркеры CD45, CD11b и F4/80, в то время как экспрессия нейтрофильного маркера Ly6G и Т-клеточного маркера CD3 была ниже 1%
