Сбор, поддержание и молекулярная идентификация горчичной тли

Начните с подготовки чашки Петри для временного обслуживания с вырезанными листьями крестоцветных и пропитанной водой фильтровальной бумагой на дне. Далее поместите пять тлей на подготовленную чашку Петри. Когда тля увеличится в численности, разрежьте первоначально вырезанные листья на четыре-шесть более мелких кусочков.

Переложите каждый маленький кусочек листа с тлей в отдельные чашки Петри, содержащие свежие листья и влажную фильтровальную бумагу. Чтобы собрать геномную ДНК тли, сначала гомогенизируйте тлю с помощью гранулированного пестика. Затем извлеките ДНК с помощью набора для выделения геномной ДНК Gene-Spin в соответствии с рекомендациями производителя.

Завершите процесс экстракции, нанеся на геномную ДНК 50 микролитров предварительно нагретой воды, не содержащей нуклеаз. Выполните ПЦР-амплификацию и секвенирование ДНК путем добавления образца ДНК в мастер-смесь ПЦР с парами праймеров. Проанализируйте продукт ПЦР с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле для подтверждения идентичности горчичной тли.

Собранные в полевых условиях тли были подтверждены как горчичные тли с использованием молекулярных маркеров, включая размер ампликона ПЦР и секвенирование Lipaphis erysimi CO1.