Метод выделения энтомопатогенных грибов важен для разработки агентов микробного контроля. Этот протокол может быть использован для выделения и отбора энтомопатогенных грибковых изолятов высокой вирулентности из образцов почвы. Этот метод включает в себя три аспекта скрининга патогенности и сочетает в себе анализ термотолерантности и производства конидий для эффективного ранжирования числа конидий.
Метод может помочь выбрать высокую вирулентность и перспективные энтомопатогенные новые грибковые изоляты для коммерциализации. Этот протокол фокусируется на биологическом контроле, он также может быть использован для обнаружения энтомопатогенных грибковых изолятов для изучения взаимодействия между вредителями и энтомопатогенными грибами. Демонстрировать процедуру будут Яо-Чиа Лю и Нянь-Тун Ни, магистрант из моей лаборатории.
Начните со сбора образца почвы, удалив один сантиметр поверхностного грунта, а затем собрав почву на глубине от пяти до 10 сантиметров с каждого участка отбора проб с помощью лопаты. После записи деталей каждого места отбора проб соберите и сохраните 100 граммов образца почвы в пластиковый пакет при комнатной температуре для выполнения протокола выделения грибов в течение трех часов. Чтобы изолировать потенциальные энтомопатогенные грибы, или EPF, добавьте 100 граммов образца почвы в пластиковый стаканчик и поместите пять червей Tenebrio molitor на поверхность почвы при комнатной температуре в темноте в течение двух недель с ежедневным наблюдением и регистрацией смертности личинок и микоза.
Держите мертвую личинку в чашке до двух недель для грибковой изоляции. Через две недели перенесите мертвых насекомых на чистую скамейку и используйте стерильную зубочистку для сбора конидий. Чтобы получить первичную культуру грибов, проведите собранные конидии на четверти крепости декстрозы агаровой среды Sabouraud или SDA в 55-миллиметровой пластине для инкубации при 25 градусах Цельсия в течение семи дней.
На восьмой день восстановите каждую первичную культуру грибов на одной 55-миллиметровой пластине SDA с четвертью прочности в ламинарной вытяжке перед инкубацией культуры при 25 градусах Цельсия в течение семи дней для получения отдельных колоний грибов. При первом скрининге патогенности поместите пять личинок Tenebrio molitor непосредственно на поверхность каждой чистой грибковой культуральной пластины при температуре 25 градусов Цельсия. После наблюдения и регистрации микоза и смертности в течение 10 дней выбирают грибковые изоляты для дальнейшего анализа.
Чтобы выполнить второй тест на вирулентность, соберите конидии каждого грибкового изолята путем вихря в течение одной минуты и подсчитайте количество конидий с помощью гемоцитометра. Когда это будет сделано, отрегулируйте суспензию конидии до концентрации в один раз 10 до 1/7 конидии на миллилитр в 0,03% растворе поверхностно-активного вещества, прежде чем распределять 10 микролитров грибковой суспензии на 55-миллиметровую четвертьсилийную пластину SDA, чтобы расти в течение семи дней при 25 градусах Цельсия в темноте. На восьмой день поместите пять личинок Tenebrio molitor непосредственно на поверхность каждой чистой грибковой культуральной пластины и запечатайте пластины пленкой Parafilm для инкубации, наблюдая за микозом и смертностью, как описано ранее.
После повторения второго теста на вирулентность в трех экземплярах для каждого грибкового изолята выберите изоляты для выполнения третьего теста на вирулентность для целевого вредителя, такого как Spodoptera litura. Соберите около одного квадратного миллиметра EPF из семидневной пластины SDA с четвертью силы, чтобы извлечь грибковую геномную ДНК с помощью набора для экстракции грибковой геномной ДНК. Затем амплифицируйте грибковый внутренний транскрибированный спейсер или область ITS методом ПЦР образца ДНК после программы ПЦР, описанной в текстовой рукописи.
После секвенирования продукта, амплифицированного ПЦР коммерческим сервисом секвенирования, используйте NCBI BLAST для поиска аналогичных грибов в базе данных NCBI и выберите относительные виды грибов для филогенетического анализа. Выровняйте несколько последовательностей и обрежьте законсервированную область последовательности вручную с помощью GeneDoc. Выполните филогенетический анализ, основанный на методах минимальной эволюции, соседского соединения и максимальной вероятности.
Чтобы изучить морфологию грибов, захватите рост колонии грибковой культуры в течение семи дней с помощью камеры и запишите рост, форму: пушистую или твердую, и цвет колоний. Чтобы наблюдать конидии в конидиофорах, соскоблите конидии из чистокультурной грибковой колонии с помощью петли прививки и перенесите споры на стеклянную горку, содержащую 0,1% раствора Tween 80. Используйте скальпель, чтобы разрезать агаровый блок грибковой колонии, а затем перенести блок агара на стеклянную горку и добавить 0,1% раствор Tween 80, чтобы смыть большую часть избытка конидий на агаре.
Далее накройте слайд крышкой для легкого микроскопического наблюдения конидий. Измерьте и запишите ширину и длину конидий и конидиофоров, чтобы сравнить разницу между различными грибковыми изолятами. Организуйте конидиальный производственный анализ, культивируя выбранный грибковый изолят на среде SDA четверти силы при температуре около 25 градусов Цельсия в темноте в течение 10 дней.
Затем готовят одну миллилитровую конидиальную суспензию грибкового изолята в 0,03% растворе поверхностно-активного вещества с последующей регулировкой концентрации до одного раза 10 до 1/7 конидий на миллилитр, как описано выше. После добавления трех капель по 10 микролитров конидиальной суспензии на пластину SDA с четвертью силы, инкубируйте культуру при 25 градусах Цельсия в темноте в течение семи, 10 и 14 дней, чтобы подсчитать спорирование грибов. В каждый момент времени отделяют пятимиллиметровый агаровый блок от центра колонии пробковым буром и переносят блок в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую один миллилитр 0,03% раствора поверхностно-активного вещества.
После вихревой трубки со скоростью 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 15 минут используйте гемоцитометр для подсчета количества конидий. Для анализа термотолерантности культивируйте выбранный грибковый изолят и подготовьте один раз от 10 до 1/7 конидий на миллилитр суспензии, как показано ранее. После вихря нагрейте конидиальную суспензию в сухой ванне при 45 градусах Цельсия в течение разных временных интервалов.
После теплового воздействия добавьте три капли из пяти микролитров конидиальной суспензии на 55-миллиметровую пластину SDA с четвертью прочности в каждый момент времени, а затем инкубируйте пластины при температуре около 25 градусов Цельсия в течение 18 часов. Чтобы определить скорость прорастания, подсчитайте количество проросших спор конидий с пятью случайно выбранными полями под световым микроскопом при 200-кратном увеличении. Рассчитайте общее эффективное число конидий или ECN с помощью формулы, а затем рассчитайте принцип компонентного анализа или PCA грибковых штаммов, как описано в рукописи.
Выберите наиболее эффективные грибковые штаммы на основе ECN или PCA для проведения теста на вирулентность целевых вредителей. Во втором тесте на вирулентность оценивали вирулентность 26 грибковых изолятов против мучных червей Tenebrio molitor. Для теста на вирулентность против Spodoptera litura были отобраны 12 грибковых изолятов с высокой патогенностью.
Чтобы лучше понять таксономические позиции грибов, 26 изолятов из первого скрининга патогенности были подвергнуты молекулярному анализу на основе области ITS. Благодаря методу очистки морфологических наблюдений грибов структуры конидиофоров можно было четко увидеть с помощью 0,1% раствора Tween 80. Цвет, форма и расположение конидий были изучены с помощью микроскопических наблюдений за колонией конидий.
ECN объединяет данные о производстве конидий и термотолерантности каждого EPF. Высокая жизнеспособность грибкового штамма наблюдалась при высоком значении ECN. Кроме того, была выявлена большая координация между ППТС и ИКЭ, что позволило предположить, что ЕЦН можно было бы использовать для оценки иерархии параметров, связанных с жизнеспособностью.
Скрининг патогенности, извлекающий грибковую ДНК и культивирующий грибковый изолят, важен в процедуре. Используя формулу расчета ECN, можно выбрать идеальные внутренние патогенные грибы. Сочетание различных видов насекомых, таких как большая восковая моль и мучный червь, вместе для приманки энтомопатогенных грибов из образцов почвы может увеличить разнообразие энтомопатогенных грибов.
Разнообразие микроорганизмов почвы является очень интересной темой во время работы этого протокола. Он также может быть дополнительно исследован в будущем с помощью этого протокола.
