Этот метод предоставляет новую информацию о том, как массово производить инфекционные конидии энтомопатогенных грибов для борьбы с важными насекомыми-вредителями в коммерческих агроэкосистемах, учитывая нынешнюю ситуацию, когда большинство инсектицидов постепенно выводятся из употребления из-за опасений их токсического воздействия на окружающую среду и здоровье человека. Методика описывает метод, используемый для обеспечения оптимального выхода КОНИДИЙ EPF при массовом производстве. Этот метод полезен для комплексной борьбы с вредителями и биологической борьбы, поскольку дает представление об эффективности массово производимых конидий для крупномасштабного управления вредными насекомыми-вредителями, устойчивыми к инсектицидам, в агроэкосистемах.
Эта процедура была разработана и продемонстрирована доктором Летоди Луки Матулве, доктором Номахолвой Фейт Стокве и профессором Антуанеттой Паулой Малан. Нагрейте один литр дистиллированной воды и выключите огонь до достижения точки кипения. Теперь добавьте 30 граммов глюкозы, четыре грамма двухосновного фосфата калия, 20 граммов дрожжевого экстракта, 15 миллилитров кукурузного крутого ликера и доведите содержимое до мягкого кипения в течение двух-трех минут.
Налейте в общей сложности 100 миллилитров среды в девять различных 250-миллилитровых колб. Поместите валотную пробку на каждую колбу и накройте вату алюминиевой фольгой в качестве пробки. Автоклав среды в колбах в течение 55 минут при 121 градусе Цельсия.
Затем дайте среде в колбах остыть и добавьте 10 миллиграммов на миллилитр стрептомицина к среде в каждой колбе. Соберите две-три бактериальные петли грибковых конидий из двух-трехнедельных пластин грибковых культур для обоих изолятов EPF. Перенесите грибковые конидии на каждые 100 миллилитров жидкой среды в колбах по 250 миллилитров в стерильных условиях и запечатайте колбы.
Инкубируйте колбы с жидкими культурами примерно при 25 градусах Цельсия на орбитальном шейкере при 140 оборотах в минуту в течение трех дней и прекратите инкубацию, как только культуры проявят признаки высокой мутности с ростом грибковой бластоспоры. Чтобы обнаружить любое возможное бактериальное загрязнение от культур, возьмите образец из 100 микролитров из каждой жидкостной колбы культуры после 24 часов инкубации и пластину на трех пластинах SDA на изолят. Инкубировать пластины в течение 48 часов при контролируемой температуре плюс-минус 25 градусов Цельсия.
Используйте небольшую поливинилхлоридную отходную трубу для создания горловины для ферментационного мешка на открытом конце автоклавного мешка и используйте автоклавную ленту для закрепления трубы. Закройте трубу стерильной ватный пробкой, чтобы обеспечить достаточный газообмен во время ферментации. Используйте пропаренный длиннозернистый белый рис в качестве твердой субстратной среды для бластоспор как Metarhizium pinghaense, так и Metarhizium robertsii.
На каждый ферментационный мешок добавьте один килограмм риса и 300 миллилитров стерильной дистиллированной воды. Аккуратно перемешайте содержимое ферментационных пакетов. Поместите их во внешние автоклавные мешки в вертикальном положении и автоклав при 121 градусе Цельсия на 55 минут.
После автоклавирования дайте субстратам остыть в течение примерно 45 минут в стерильных условиях. Снимите крышку каждой из колб для жидких культур Metarhizium pinghaense и Metarhizium robertsii под ламинарной струей и воспламените ободок каждой колбы в течение 10 секунд. Налейте 100 миллилитров жидких культур в ферментационные мешки, удалив ваты с их шейки пробки.
Поместите ватные пробки обратно и покройте верхнюю часть шеи сумки хирургической бумагой, закрепленной резинкой. Поверните верхнюю часть сумки и перемешайте содержимое пакета, встряхивая и манипулируя субстратом путем массажа. Инкубируйте мешки при температуре около 25 градусов по Цельсию, сплющивая субстрат в мешках, чтобы предотвратить образование толстых слоев.
Через два-три дня после прививки и инкубации, когда произошел видимый рост мицелиала и связывание субстрата грибком, разорвите субстрат в ферментационных мешках, массируя содержимое пакетов. После ферментации переместите спорулированные культуры в 26-30-килограммовые коричневые бумажные пакеты и высушите грибковые культуры в течение 10-12 дней до их использования в испытаниях. Чтобы улучшить прочность бумажных пакетов на растяжение, горизонтально отрежьте 1/3 верхней части пакета и выровняйте нижнюю часть пакета.
Аккуратно рассыпьте субстрат в каждом ферментационном мешочке. Отрежьте угол каждого пакета и медленно перенесите всю культуру в бумажные пакеты через пространство, оставленное отрезанным углом. Пометьте каждый бумажный пакет, сложите верхний конец каждого пакета дважды и закройте скобами, чтобы создать треугольную структуру палатки.
Поместите мешки на сушильные стеллажи для проволоки, чтобы обеспечить правильную, равномерную сушку при контролируемой температуре около 25 градусов по Цельсию и низкой влажности от 30 до 40% Собирайте грибковые конидии из культур с использованием трех вложенных сит, установленных на поддоне для сбора. Медленно загрузите образец сухой культуры на сетку ETS No 35 и сито. Поместите крышку на сито, чтобы предотвратить выброс грибковых конидий в воздух.
Добавьте от 10 до 12 стеклянных шариков в сита, чтобы помочь прохождению грибковых конидий через сетчатые экраны и избежать удержания конидий в сите, что может привести к снижению восстановления спор. Заклейте лентой и ситовые соединения с помощью электрической ленты. Поместите сита на вибрационный шейкер, оснащенный липкой прокладкой, чтобы закрепить поддон для сбора и сита в течение 20-25 минут со скоростью от 560 до 640 вибраций в минуту.
Извлеките тестовые сита из поддона для сбора, соберите конидии и храните собранные конидии в герметичных и водонепроницаемых пакетах-молниях для длительного хранения. В среднем примерно 1,83 грамма сухого Metarhizium robertsii conidia было собрано из шелушащегося ячменного субстрата, тогда как из субстрата было собрано ноль Metarhizium pinghaense. Ни один сухой грибковый конидий не был собран из шелушащегося овсяного субстрата ни для одного из видов Metarhizium.
Существенная разница наблюдалась между двумя видами Metarhizium в расчетном среднем конидии на грамм, собранный из рисовых зерен. Metarhizium robertsii имел немного более высокое среднее количество конидий на грамм, чем Metarhizium pinghaense. Между двумя видами Metarhizium не наблюдалось существенной разницы в предполагаемом количестве конидий, присутствующих на отработанном рисовом субстрате.
Тем не менее, Metarhizium pinghaense имел несколько более высокую конидию на рисовом субстрате, чем Metarhizium robertsii Нет существенных различий в двух видах Metarhizium в их общей урожайности конидий, полученных из культур рисового субстрата. Тем не менее, Metarhizium pinghaense дал немного более высокий выход конидий, чем Metarhizium robertsii, который дал более низкий конидиальный выход. Сложной частью этого метода является загрязнение субстрата через инокуляцию загрязненным бластоспором инокулята.
Таким образом, всегда обеспечивайте стерильность во время работы. Эта демонстрация помогает учащимся эффективно воспроизводить технику без неуклюжих ошибок, которые могут привести к завершению всего процесса.
