Начните с огневой полировки трех пастбищных пипеток с помощью горелки Бунзена, создавая уменьшающиеся диаметры. Затем простерилизуйте брюшную полость усыпленной беременной мышиной матери с 70% этанолом. Разрежьте брюшную полость от лобкового синтеза до мечевидного отростка грудной клетки.
Теперь извлеките маточный рог из брюшной полости и поместите его в 100-миллиметровую пластину, наполненную ледяным раствором HBSS. Извлеките и отделите все эмбрионы от промытой матки с помощью тонких щипцов. Быстро обезглавьте извлеченные эмбрионы мышей и поместите головы в 60-миллиметровую чашку Петри, наполненную HBSS.
Поместите пару тонких щипцов в полость глаза, чтобы удерживать мозг. С другой парой снимите кожу и череп до тех пор, пока не станет виден мозг. Вытащите мозг из обонятельных луковиц из черепа и переверните его вверх ногами.
Наблюдайте за корой головного мозга на вентральной стороне и гипоталамусом на дорсальной стороне. Используйте изогнутые щипцы для удаления слоя мозговых оболочек и кровеносных сосудов до тех пор, пока мозг не станет белым и чистым, и отделите область гипоталамуса от остальной части мозга. Разрежьте гипоталамус на три-четыре небольших мелких кусочка и с помощью пипетки перенесите кусочки в 15-миллилитровую трубку.
Далее заполните тюбик шестью миллилитрами HBSS. Затем добавьте Enzyme Mix 1, как только ткань осядет и надосадочная жидкость будет удалена. Инкубируйте трубку на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, помешивая каждые пять минут, чтобы снова суспендировать ткань.
Теперь добавьте 30 микролитров Enzyme Mix 2 и диссоциируйте ткань, пипетируя вверх и вниз 10 раз с помощью пастбищной пипетки большого диаметра. После дополнительной 10-минутной инкубации добавьте оставшиеся 15 микролитров Enzyme Mix 2. Используя две отполированные огнем пипетки уменьшающегося диаметра, пипетируйте ткань 10 раз.
Сразу же добавьте в тюбик 10 миллилитров HBSS с 0,5% BSA. Затем центрифугируйте пробирку при 300 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре HBSS с 0,5% BSA.
