Начните с помещения меченых антителами личинок дрозофилы в 0,2% PBST на предметное стекло. Регулируется под стереомикроскопом, следя за тем, чтобы внутренняя поверхность тушки личинки была обращена вверх. Впитайте излишки раствора PBST с помощью салфетки.
Затем аккуратно добавьте каплю монтажного средства Anti-Fade. Затем поместите на предметное стекло покровный листок, прикрывающий рассеченные личинки медленно и аккуратно, не допуская образования пузырьков. Закрепите чехол на месте, нанеся лак для ногтей по его краям.
Храните предметное стекло в темном месте, чтобы свести к минимуму затухание флуоресценции. Для получения изображений используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с 63-кратным масляным иммерсионным объективом. Затем отрегулируйте длину волны и мощность лазера в соответствии с требованиями эксперимента.
Чтобы определить нервно-мышечные соединения и получить изображения мышц 4 в сегменте А 3, выберите лазер 488 нм для активации альфа-тубулина или Futsch и 546 нм для активации трека визуализации HRP. Измените параметры, чтобы получить размер кадра 1,024 на 1,024 пикселя, цифровой зум 1,0 и интервал изображения 0,8 микрометра. Чтобы визуализировать микротрубочки в мышце, сделайте снимки мышцы номер два в сегментах от трех до пяти сегментов, так как у них меньше ветвей трахеи.
Выберите лазер 488 нм для активации альфа-тубулина и 633 нм лазер для активации трека визуализации T3605. Настройте параметры изображения до размера кадра 1,024 на 1,024 пикселя, цифрового зума 2,0 и интервала изображения 0,4 микрометра. Как пре-, так и постсинаптические организации микротрубочек нервно-мышечного соединения были помечены анти-альфа тубулином.
Окрашивание по Футчу отражало обилие стабильных микротрубочек в пресинаптических нейронах. Снижение интенсивности сигнала анти-Futsch наблюдалось при сверхэкспрессии микротрубочек, разрывающих белок Katanin 60, в пресинаптических нейронах. Интенсивность окрашивания ствола аксона была сильнее, чем у ветвей.
Мутации Katanin 60 привели к увеличению петель микротрубочек. Сверхэкспрессия Katanin 60 вызывала короткие фрагменты микротрубочек внутри клеммных кнопок. Окрашивание альфа-тубулином продемонстрировало четкую сеть микротрубочек вокруг ядра.
Мышечные клетки имели значительно повышенную интенсивность перинуклеарных микроканальцев и демонстрировали более сильные пучки у мутанта Катанин 60. Сверхэкспрессия приводила к фрагментации волокон микротрубочек.
