Приготовьте 12-миллилитровое разведение 60%-ной и 70%-ной разделительной среды в конических пробирках объемом 50 миллилитров. Затем подготовьте градиент снизу вверх, добавив четыре миллилитра за раз 60%-ного разведения над 70%-ным разведением с помощью пятимиллилитровой пипетки. Затем аккуратно нанесите 12 миллилитров гепаринизированной крови поверх градиента плотности и центрифугируйте при 200G в течение 15 минут при комнатной температуре.
Откажитесь от плазмы и слоев мононуклеарных клеток. Затем осторожно переложите примерно 7,5 миллилитров слоя над гранулой эритроцита в две конические пробирки по 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при температуре 300 г в течение пяти минут при температуре 19 градусов Цельсия.
Приступайте к промывке гранул ячейки сбалансированным солевым раствором Хэнкса или HBSS. Затем проводят гипотонический лизис и удаляют оставшиеся эритроциты. После удаления надосадочной жидкости осторожно ресуспендируйте полиморфноядерные нейтрофилы в оставшемся буфере и перенесите их в ледяную микроцентрифужную пробирку.
Далее переносят три одномиллионные аликвоты клеточной суспензии на чистое предметное стекло. Окрашивание быстрым паноптическим методом для оценки морфологии и чистоты клеток. Понаблюдайте за клетками под микроскопом и насчитайте 300 случайных клеток в каждой лунке.
Отметьте нейтрофилы и другие типы клеток, чтобы оценить чистоту разделения. Затем переносят один микролитр клеточной суспензии в 49 микролитров 0,2%-ного красителя трипанового синего и подсчитывают мертвые и жизнеспособные клетки с помощью камеры Нойбауэра. Отрегулируйте концентрацию клеток до 6 667 клеток на микролитр с 50% аутологичной плазмой и 50% HBSS с добавлением кальция и магния.
Затем равномерно распределите клеточную суспензию по 1,5-миллилитровым микроцентрифужным пробиркам, соответствующим условиям испытаний, включая отрицательный контроль. Подготовьте систему активации для каждого состояния, гарантируя, что конечная концентрация клеток останется на уровне 6 600 полиморфноядерных нейтрофилов на микролитр. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия без вращения.
