Мечение и окрашивание перицитов мозга крысы для флуоресцентной визуализации

Чтобы пометить перициты, добавьте флуоресцентный краситель TO-PRO-3 в искусственную спинномозговую жидкость или ACSF. Теперь инкубируйте только что нарезанный мозг крысы в насыщенном красителем ACSF в течение 20 минут в темной среде при комнатной температуре. Далее перенесите сетчатое ситечко из нейлоновой сетки со срезами мозга в камеру для промывки шестилуночных пластин.

Дайте мозговым срезам отдохнуть в камере в течение 10 минут. Чтобы пометить нежизненные перициты, инкубируйте помеченные TO-PRO-3 срезы мозга в конъюгированном изолектине B4 при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут в темноте. После инкубации промойте срезы мозга в искусственной спинномозговой жидкости в течение 15 минут.

Затем поместите срезы мозга в ACSF, отравленные 5% углекислым газом и 95% кислородом. К этому добавляют йодид пропидии в концентрации 37 микромоляров при 37 градусах Цельсия. Чтобы остановить поглощение красителя и свести к минимуму фоновую маркировку, промойте препараты в течение 15 минут в ACSF.

В нормальных физиологических условиях перициты мозга не испытывают клеточной гибели. Были обнаружены жизнеспособные перициты, которые не были окрашены йодидом пропидия. Модели SAH должны жизненно важные перициты в микроциркуляторном русле.

Также были обнаружены нежизненные перициты. Меченные йодидом пропидиумом нежизненные перициты оставались прикрепленными ко всему микроциркуляторному руслу.