Удаление мусора и эритроцитов из суспензии клеток ЦНС мышей EAE

Для начала необходимо получить клеточную гранулу после диссоциации ткани ЦНС и повторно суспендировать ее 3 100 микролитрами DPBS в одной 15-миллилитровой пробирке. Не делайте вихрей. Добавьте 1 800 микролитров раствора для удаления мусора из набора для диссоциации мозга взрослого человека в две объединенные суспензии клеток ЦНС.

Переверните трубку и перемешайте суспензию, затем аккуратно обложите ее 4 миллилитрами холодного DPBS и наблюдайте за четким градиентом. Центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при 3 000 г при 4 градусах Цельсия с полным ускорением и без перерыва. После центрифугирования образуются три фазы.

Полностью отберите две верхние фазы и выбросьте их, чтобы не осталось остатков миелина. Залейте трубку холодным ДПБС объемом до 14 миллилитров и закройте ее. С усилием переверните трубку на верстаке до тех пор, пока гранула элемента не отделится от дна трубки.

Центрифугируйте образец и полностью отасканируйте надосадочную жидкость. Для удаления эритроцитов добавьте 1 миллилитр раствора для удаления эритроцитов в клеточную гранулу. После повторного суспендирования гранулы инкубируйте раствор в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Затем добавьте 10 миллилитров холодного PB-буфера, центрифугируйте образец и полностью отасуньте надосадочную жидкость. Для подсчета клеток клеточную суспензию разбавляют в 50 раз в PB-буфере, а затем разбавляют от 1 до 10 раз в 0,4% растворе Trypan Blue. Затем определите количество клеток, используя усовершенствованную счетную камеру.