Для начала поместите вкладыши для клеточных культур в 24-луночный адаптер для культуры тканей. Предварительно покройте апикальную сторону вкладышей 100 микролитрами внеклеточного матрикса базальной мембраны или BME в энтероидной питательной среде. Покройте дополнительную вставку для использования в качестве контроля при измерении целостности барьера.
Затем инкубируйте пластину с покрытием при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа в течение одного часа. После завершения инкубации аспирируйте 3D-энтероидную питательную среду. Соберите энтероиды подвздошной кишки крупного рогатого скота в 1 миллилитре ледяной промывочной среды.
С помощью скребка для клеток отделите купола и соберите их в коническую трубку объемом 15 миллилитров. С помощью наконечника пипетки объемом 1 миллилитр разотрите 30 раз до образования энтероидных фрагментов. Затем используйте наконечник пипетки объемом 200 микролитров, чтобы дополнительно растереть около 40 раз, чтобы разбить фрагменты энтероидов.
Доведите объем тюбика до 10 миллилитров ледяным промывочным средством. Затем центрифугируют пробирку при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, включая слой BME.
Далее через каждые четыре купола ресуспендируйте гранулу в 1 миллилитре предварительно подогретого экспресс-фермента TrypLE. Перелейте смесь в 24-луночную тарелку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислом газе в течение 10 минут. Аккуратно пропипетируйте смесь пипеткой объемом 1 миллилитр для дальнейшего расщепления энтероидов.
Затем пипеткой пропикапывают смесь пипеткой объемом 200 мкл, чтобы разбить фрагменты на отдельные клетки. Используйте шприц объемом 3 миллилитра, оснащенный стерильной иглой 22-го калибра, для аспирации и дозирования клеточной суспензии четыре раза, чтобы получить одноклеточную суспензию. С помощью микроскопа контролируйте диссоциацию клеток до тех пор, пока 80% энтероидов не будут расщеплены на отдельные клетки.
Теперь соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку. Добавьте четыре объема промывочной среды FBS для тушения реакции. Затем отфильтруйте энтероиды через предварительно покрытое 40-микрометровое ситечко для клеток дважды в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.
Центрифугируйте суспензию при 300 г в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Отсасывайте надосадочную жидкость в центрифужную пробирку диссоциированной суспензии бычьих подвздошных энтероидных клеток. Ресуспендируйте гранулу в небольшом объеме органоидной питательной среды.
Затем используют метод исключения красителя Trypan Blue и гемацитометр для определения жизнеспособности клеток. Осторожно удалите излишки раствора покрытия со вкладыша для клеточной культуры. Высевают 200 микролитров одноклеточной суспензии на апикальную поверхность предварительно покрытой культуральной вставки.
Теперь добавьте 700 микролитров полной среды FBS на базальную боковую сторону вкладыша. Переместите пластину примерно 10 раз в форме цифры восемь, чтобы равномерно распределить ячейки по вставке. Затем поместите тарелку на подогреватель тарелок в шкаф биобезопасности на 10 минут.
Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа в течение 48 часов. После инкубации замените среды на верхушечном и базальном компонентах свежими энтероидными питательными средами. На следующий день удалить среду из апикального и базального боковых отделов.
Тщательно промойте вкладыш PBS и замените его энтероидной дифференцирующей средой, дополненной только ингибиторами. Формирование энтеросферы наблюдалось через несколько часов после культивирования покрытых пластинами склепов крупного рогатого скота. Через два дня просвет сфер был хорошо очерчен, а на четвертый день наблюдались зарождающиеся структуры.
Зрелые энтероиды наблюдались к седьмому дню. Иммуноокрашивание семидневных 3D-энтероидов показало наличие различных клеточных линий. Белок Е-кадгерин локализован в месте соединения адгезии.
Энтероиды были положительными на энтероэндокринные клетки и лизоцим-продуцирующие клетки Панета. Конфлюидные 2D-монослои наблюдались менее чем за одну неделю культивирования.
