Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как, как генный продукт, который трудно выразить в E.Coli очищается. Основными преимуществами этого метода является то, что никакая энзиматическая реакция, кроме ПЦР, не является носителем, и общие приложения для очистки белка могут быть использованы. Хотя этот метод может обеспечить понимание очистки белка в стрептококковых мутанов, он также может быть проинформирован о других видов микробиоты.
Демонстрация процедуры будет д-р Мамико Ямасита, аспирант из нашей лаборатории. После грунтовки дизайна и геномной извлечения ДНК из стрептококковых мутанов, выполните первый ПЦР с использованием стрептококкового мутана дикого типа и GFC нарушенного генома стрептококка мутанов в качестве шаблонов ПЦР. Усилить регионов укрывательство вниз по течению часть гена gtfC и тех, укрывательство спектромицина сопротивления гена с помощью подготовленных gtfC-вперед и обратной грунтовки и spc R-вперед и обратной грунтовки.
Затем, электрофорез каждого продукта ПЦР на 1%agarose гель. Используйте гелеобразуя, чтобы вырезать желаемые фрагменты ДНК примерно 1000 пар основания и 2000 базовых пар из геля в микроцентрифуг трубки. Добавьте 500 микролитров solubilizing буфера в каждую трубку и инкубировать их в течение 10 минут при 56 градусах по Цельсию, чтобы растворить ломтики геля.
Очистить фрагменты с помощью кремнезема мембраны на основе метода извлечения геля. Выполните второй ПЦР, используя продукты первого ПЦР в качестве шаблонов ПЦР с вложенными вперед и вложенными реверсами. Когда второй продукт ПЦР не может быть подтвержден электрофорезом, должна быть разработана другая вложенная грунтовка.
электрофорезе пять микролитров смеси ПЦР на агарозовом геле. Подтвердите генерацию соответствующего ампликона из примерно 3000 базовых пар изображением окрашивания бромистого геля этидия и продолжайте в соответствии с рукописью. Теперь смешайте пять микролитров концентрированного второго продукта ПЦР с 50-микролитровой алоцитой ледяных, компетентных клеток стрептококка дикого типа, замороженных ранее.
Добавьте смесь в куветт электропорации и поместите кюветт в камеру cuvette аппарата электропорации. Дайте одному электрическому импульсу 1,8 киловольты, 600 ом и 10 микрофарадов в течение 2,5 миллисекунд к клеткам. Добавьте в куветт 500 микролитров бульона для инфузии головного сердца.
Сразу же распространение от 10 до 100 микролитров подвески на мозг сердца инфузии овека пластин, содержащих спектромицин. Инкубировать пластины в течение двух-шести дней при 37 градусах по Цельсию, пока колонии выросли достаточно, чтобы быть подобраны. После генерации стрептококка мутанов полихистидин кодирования последовательности включены штамма и ночной прививки без спектромицина в соответствии с рукописью, центрифуга бактериальной культуры подвески в течение 20 минут при 10000 раз г при четырех градусах по Цельсию.
Перенесите культурный супернатант в трехлитровый стеклянный стакан. Чтобы сконцентрировать белки из культурного супернатанта, поместите двухлитровый супернатант на магнитный мешалку и начните энергичное перемешивание. Добавьте 1, 122 грамма сульфата аммония и дайте осадку сформироваться с энергичным перемешиванием при четырех градусах Цельсия в течение четырех часов или на ночь. Следующий.
центрифуга сульфата аммония осаждается раствор при 15 000 раз г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Декант супернатант. С помощью шпателя соберите осадок и перенесите его в стеклянный стакан на 200 миллилитров.
Повторное производство гранул в 35 миллилитров связывающего буфера. Затем перенесите каждый примерно 25 миллилитров суспензии в регенерированный целлюлозный диализ. Поместите диализную трубку в 2,5 литра перемешивающего буфера на мешалки при четырех градусах по Цельсию, чтобы облизать подвеску.
Замените раствор диализа через два часа и продолжайте диализ на ночь. Затем перенесите диалированную суспензию из трубки в центрифуги и поместите трубки в центрифугу при 20 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью оборудования для фильтрации секций залейте супернатант 0,2-микрометровым мембранным фильтром для фильтрации.
Перенесите фильтрат в 75-миллилитровую колбу. Чтобы фракционировать полихистидин-тегом gtfSI из фильтровательной подвески, сначала подготовить иммобилизованный металл сродства хроматографии. После равновесия смолы в соответствии с рукописью, закрыть Хоффман щепотку петух.
Добавьте пять миллилитров фильтрованной подвески в столбец, чтобы сделать суспензию. Затем перенесите всю суспензию на оставшуюся фильтрованную подвеску и осторожно закружить смесь в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Загрузите смесь обратно в столбец.
Откройте Hoffman щепотку петух, чтобы удалить подвеску гравитационным потоком. Вымойте смолу IMAC с 20 миллилитров связывающего буфера, а затем, elute 20 миллилитров элюционного буфера для получения рекомбинантного gtfSI. После этого загрузите элуат в центробежную ультрафильтральную трубку и центрифугайте раствор 2000 раз г в течение одной-пяти минут, чтобы сконцентрировать раствор.
Освободите фильтратный контейнер и добавьте в трубку 15 миллилитров буфера хранения. Центрифугировать образец снова и повторить процесс еще два раза. Рекомбинантный раствор gtfSI, наконец, концентрируется примерно до одного миллилитра.
Перенесите концентрат в трубку микроцентрифуга и храните при четырех градусах Цельсия. Продолжить с остальным функциональным протоколом восстановления. В этом протоколе электрофорез агарозного геля показывает, что размер каждого ампликона от первого ПЦР и второго ПЦР соответствовал прогнозируемому размеру.
Колонии стрептококковых мутанов были преобразованы со вторым продуктом ПЦР и покрыны на пластинах инфузионных овсяных пластин мозга, содержащих спектромицин. Колония ПЦР продукты работают на агарозный гель показывает, что каждый amplicon был предсказанного размера. Белок, очищенный от иммобилизованной хроматографии сродства металла, был замечен как единая полоса SDS-PAGE.
Западная помарка, выполненная с использованием анти-полихистидина антитела, подтвердила, что наблюдаемая полоса была ожидаемым полинистидин-помеченным белком 160 килодалтонов. Биопленка, полученная из сахарозы, была замечена только со стрептококком мутанов дикого типа и стрептококковыми мутанами His-gtfC, которые образовывались на стенке трубки в присутствии 1% сахарозы. Этого не наблюдалось в стрептококке mutans delta gtfC.
Однако добавление 25 микрограммов рекомбинантного gtfSI восстановило способность адептиента к формированию биопленки в стрептококке mutans delta gtfC. Поскольку успех этого метода зависит от второго усиления ПЦР, второй продукт ПЦР должен быть подтвержден электрофорезом. Уже, гистидин типа белка, полученного с помощью этого метода также созыва функциональных кислот, таких как белково-белковые взаимодействия.
После своего развития, этот метод, в сочетании с нарушением гена, проложил путь для исследователей в области микробиологии, чтобы исследовать функцию генов.
