Препарат библиотеки CDNA из лизата мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанного лекарственными препаратами, для секвенирования мРНК

Для начала соберите обработанные препаратом PBMC с помощью центрифугирования и соберите лизат клеток в ПЦР-планшет. Центрифугируйте пластину, чтобы собрать лизат на дне. Далее выполняют денатурацию мРНК с помощью амплификатора.

Затем добавьте шесть микролитров реакционной смеси обратной транскриптазы в каждую лунку, чтобы получить общий объем 12 микролитров. Герметизируйте пластину, чтобы защитить ее от загрязнения и предотвратить испарение. Центрифугируйте пластину после кратковременного вихряния.

Поместите пластину на амплификатор и запустите программу реакции обратной транскрипции. После обратной транскрипции центрифугируют ПЦР-планшет, добавляют в каждую лунку по 15 микролитров смеси для предварительной амплификации и запечатывают ее. Поместите герметичную пластину на амплификатор и запустите реакцию предварительного усиления.

Чтобы очистить кДНК, добавьте в каждую лунку шарики магнитной очистки и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите ПЦР-планшет на магнитную стойку на пять минут или до тех пор, пока шарики не разделятся. После этого аккуратно извлеките надосадочную жидкость.

Держа пластину на магнитной стойке, аккуратно введите 100 микролитров свежеприготовленного 80%-ного этанола для очистки шариков. После 30-секундной инкубации с помощью пипетки удалите надосадочную жидкость. Дайте шарикам высохнуть на воздухе на магнитной стойке в течение пяти минут или до тех пор, пока этанол полностью не испарится и шарики не перестанут выглядеть блестящими.

Сняв пластину с магнитной стойки, повторно взвесьте шарики в 20 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Перемещайте пластину на магнитной стойке до тех пор, пока шарики не будут разделены. Переложите элюит на свежую ПЦР-пластину, подготовленную для контроля качества кДНК и маркировки.

Для мечения добавьте три микролитра смеси для мечения для каждой реакции на новую ПЦР-планшет. Добавляйте один микролитр кДНК в каждую реакцию. Немедленно запустите реакцию тегментации.

Затем нейтрализуйте реакцию, добавив в каждую реакцию один микролитр нейтрализованного буфера меток. Для обогащения ПЦР добавьте девять микролитров смеси для обогащения ПЦР в каждую реакцию, чтобы получить общий объем 14 микролитров. Запустите программу обогащения ПЦР.