Печеночная дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в 2D-культурах

Для начала покройте каждую лунку шестилуночного планшета одним миллилитром матрицы базальной мембраны и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Удалите покрытую матрицу с пластины и добавьте индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки, полученные в среде AK02N с добавлением 10 микромолярного ингибитора ROCK. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех дней.

Через три дня, в нулевой день инициирующей печеночной дифференцировки, промойте клетки один раз средой RPMI 1640. Затем, чтобы инициировать дифференцировку энтодермы, добавьте в пластину RPMI B27 GlutaMAX с добавлением от трех до шести микромоляров CHIR 99021 и 100 нанограммов на миллилитр активина А. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.

В первый день замените существующую среду на RPMI B27 GlutaMAX с добавлением 50 нанограмм на миллилитр активина А. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение 24 часов. На второй день, чтобы вызвать дифференцировку печеночных предшественников, замените существующую среду средой RPMI B27 GlutaMAX с добавлением 1% диметилсульфоксида и продолжайте инкубацию в течение пяти дней. На седьмой день, чтобы начать созревание гепатоцитов, переключитесь на среду для созревания гепатоцитов и инкубируйте в течение 20 дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

На 27-й день индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки демонстрировали многоугольную форму клеток и округлые ядра, характерные для гепатоцитов.