После 27 дней начала печеночной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека промойте клетки двумя миллилитрами PBS на лунку. Приготовьте раствор фермента в буфере ADS с использованием данных компонентов. Добавьте один миллилитр раствора на лунку шестилуночной тарелки.
Поместите пластину с температурой 37 градусов Цельсия на вращающийся шейкер примерно на два часа, чтобы отсоединить ячейки от пластины. Подтвердите отслоение клеток под микроскопом, затем пипеткой распустите клеточную суспензию в отдельные клетки и соберите их в 50-миллилитровую пробирку, содержащую среду для созревания гепатоцитов. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200G в течение пяти минут при 18 градусах Цельсия.
И с помощью аспиратора удалить надосадочную жидкость. Чтобы окрашивать митохондрии клеток, ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах среды для созревания гепатоцитов, содержащей 100 наномолярных TMRM. Инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, защищая их от света.
Снова центрифугируйте клеточную суспензию и повторно суспендируйте гранулу в одном-пяти миллилитрах холодного буфера ADS, содержащего 2% FBS. После подсчета клеток поместите 500 000 клеток в пробирку объемом 1,5 миллилитра и пометьте ее как контрольную группу без первичных антител. Центрифугируйте оставшуюся клеточную суспензию при 200G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость.
Добавьте 100 микролитров разведенного первичного антитела на один миллион клеток. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте на льду в течение 50 минут. После инкубации клеточную суспензию центрифугируют и дважды промывают клетки холодным буфером ADS, содержащим 2% FBS.
Теперь добавьте 100 микролитров разведенного вторичного антитела на один миллион клеток к первичному антителу, окрашенным или неокрашенным клеткам, и инкубируйте в течение 30 минут на льду. Снова центрифугируйте суспензию клеток и дважды промойте клетки холодным буфером ADS, содержащим 2% FBS. После ресуспендирования клеток в буфере ADS отфильтруйте их через ситечко с защелкой и поместите пробирку на лед.
