Для начала соберите эмбрион рыбки данио и выращивайте его до 72 часов после оплодотворения в инкубаторе при температуре 28,5 градусов по Цельсию. Одновременно подготовьте химические вещества для испытания в нужной концентрации. Исследуйте эмбрионы через 72 часа после оплодотворения.
Удаляют мертвые или невылупившиеся эмбрионы. Поместите 10 эмбрионов в каждую шестисантиметровую чашку для культивирования тканей с девятью миллилитрами среды Е3. Они называются экспонированными пластинами.
Пометьте каждую экспопозиционную пластину с указанием соединения, названия, концентрации экспозиции и номера репликации. Добавьте по одному миллилитру раствора экспозиции в каждую пластину, начиная с самой низкой концентрации, и аккуратно покрутите пластину. Для соединений с низкой растворимостью замените все 10 миллилитров среды раствором для воздействия.
Запишите последовательность, в которой растворы соединений были добавлены к эмбрионам, затем инкубируйте планшеты в увлажненной камере в инкубаторе при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение 48 часов. Чтобы начать анализ вибрационного испуга, включите компьютер и вибрационное устройство. Создайте электронную таблицу для конфигурационного файла.
Включите информацию об экспозиции для каждого из пяти положений пластины, указав состав, концентрацию и репликацию. Откройте общий пользовательский интерфейс, или программу с графическим интерфейсом, для набора для анализа вибрационного испуга. Выберите различные положения в программе с графическим интерфейсом, чтобы проверить движение камеры и понаблюдать за реакцией камеры.
Извлеките планшет с образцом из инкубатора. Поместите их в пять отведенных для этого положений и дайте эмбрионам отстояться в течение нескольких минут. В программе с графическим интерфейсом нажмите кнопку записи, и появится новое окно.
В этом окне выберите подготовленный ранее конфигурационный файл. Убедитесь, что описание образца совпадает с образцами в каждой позиции. Обратите внимание на то, как загорается светодиод при активации звукового импульса программой.
После записи камера вернется в исходное положение, и программное обеспечение начнет сжимать файлы. Замените измеренные образцы следующим набором и приступайте к следующему запуску, как показано на рисунке. Затем соберите экспозиционные растворы со всех измеренных планшетов, используя сито для одновременного удержания эмбрионов.
Чтобы начать анализ данных, откройте видеоданные с помощью виртуального дубляжа или другого программного обеспечения для просмотра. Визуально оценить количество эмбрионов, реагирующих на звуковой пульс. Запишите в электронную таблицу название соединения, репликацию, концентрацию соединения и процент подвижных эмбрионов.
Проводите эталонный анализ концентрации с помощью рабочего процесса KNIME со встроенными скриптами R. Оценка неподвижности у необработанных эмбрионов дикого типа показала среднюю неподвижность 14,33% при воздействии вибрационного стимула, с вариациями в разных кладках. Расчеты эталонных концентраций для воздействия трикаина на подвижность показали снижение подвижности при концентрации 1%, прекращение активности выше 2,5% при контрольной концентрации 50 164,9 микромоляра.
Пример субоптимального анализа показал несоответствия в реакциях эмбриона, что указывает на проблемы с развитием, влияющие на устойчивость реакции испуга.
