אנו מודים לתודה על הסיוע הטכני המצוין של צוות התמיכה במתקן הדגים ומרכז ההקרנה של IBCS-BIP. עבודה זו קיבלה מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מספר 965406 (PrecisionTox). פלט זה משקף רק את עמדת המחברים, והאיחוד האירופי אינו יכול להיות אחראי לכל שימוש שעשוי להיעשות במידע הכלול בו.

כל הגידול והטיפול בדגי זברה בוצעו בהתאם לתקנים הגרמניים להגנה על בעלי חיים ואושרו על ידי ממשלת באדן-וירטמברג, Regierungspräsidium Karlsruhe, גרמניה (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).
1. הכנת תמיסות מלאי של כימיקלים לבדיקה
<ol><li>תייגו את בקבוקון הזכוכית (או האליקוט הכימי) עם שם התרכובת/קיצור, ריכוז המלאי ותאריך ההכנה. לדוגמה, CdCl2_2.5 גרם· L-1_210813.</li>
	<li>צנטריפוגה את aliquot כימי ב 2000 x גרם במשך 1 דקה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>מתחת למכסה אדים, שוקלים את התרכובת (במידת הצורך) על סולם רגיש ל-0.001 גרם ומעבירים אותה לבקבוקון המסומן. אם התרכובת היא נוזל, מוסיפים אותה לבקבוקון באמצעות פיפטה וקצה פיפטה מפלסטיק. הערה: לדוגמה, עבור מלאי הטריקאין מתאן-סולפונט ששימש בדוגמת התוצאה שמוצגת באיור 2, 400 מ"ג נשקלו לתוך הבקבוקון המסומן.</li>
	<li>הוסיפו ממס (למשל, מים טהורים סטריליים או דימתיל סולפוקסיד (DMSO), בהתאם לתכונות הפיזיקוכימיות של התרכובות) באמצעות פיפטה וקצה פיפטה מפלסטיק. במידת האפשר, מים הם הממס המועדף. הערה: לדוגמה, עבור מלאי טריקאין, פתרון 15.3 mM ב 100 מ"ל מים הוכנה.</li>
	<li>אוטמים את הבקבוקון, מנערים בעדינות ובודקים משקעים.</li>
	<li>הכינו תמיסות מלאי מדוללות (במידת הצורך) בבקבוקוני זכוכית באמצעות פיפטות וקצוות פיפטה מפלסטיק. הערה: לדוגמה, לא היה צורך בדילול נוסף עבור מלאי הטריקאין.</li>
	<li>אחסנו את תמיסות המלאי בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.</li>
	<li>לאחסן את aliquot הכימי הנותר באותם תנאים כמו קודם.</li>
	<li>רשום מידע על מלאי aliquot במחברת המעבדה.</li>
</ol>2. איסוף וגידול עוברים של דגי זברה
<ol><li>לאסוף עוברים בשלבי מחשוף (שלב 2-8 תאים) מהשרצה טבעית של הזדווגויות קבוצתיות בצלחות תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ.</li>
	<li>בחרו אצווה באיכות מתאימה: פחות מ-10% ביצים לא מופרות/מתות.</li>
	<li>נקו את הכלים (הוציאו ביצים לא מופרות, פסולת, קשקשים וכו').</li>
	<li>מניחים 60 עוברים לכל צלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ ב-15 מ"ל של E3 בינוני (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)25.</li>
	<li>הכניסו כלים לתא לח שהוכנו על ידי פריסת מגבות נייר ספוגות במים.</li>
	<li>יש לגדל עוברים עד 72 HPF באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. הכנת דילול עובד של כימיקלים לבדיקה
<ol><li>הוציאו את תמיסת המלאי מהמקפיא בטמפרטורה של -20°C ותנו לה להפשיר.</li>
	<li>אם מסיסות התרכובת גבוהה מספיק, הכינו דילולים סדרתיים בתווך E3 בבקבוקי זכוכית, 1 מ"ל לכל שכפול לכל ריכוז. יש לוודא שהריכוז גבוה פי 10 מריכוז החשיפה הרצוי. כך נמנע הצורך לשנות את כל התווך של העוברים בתחילת החשיפה. במקרה של מסיסות נמוכה, הכינו את הדילולים הטוריים ישירות בריכוזי החשיפה הרצויים, 10 מ"ל לשכפול לריכוז.</li>
	<li>בדוק משקעים (במידת הצורך). אם הפתרון זירז, לרשום את זה, ולאחר מכן לדלל עוד יותר כדי להשיג את הריכוז הגבוה הבא. בדוק שוב אם יש משקעים. חזור על הפעולה עד שאין משקעים.</li>
	<li>בדוק את ה- pH של תמיסת החשיפה. אם אתם מחוץ לטווח של pH 7.0-8.5, רשמו זאת, והכינו את התמיסות ב-E3 המכילות 5 mM HEPES/pH 7.4, תוך התאמת ה-pH עם HCl או NaOH.</li>
	<li>יש להשליך חומרי חשיפה שאינם בשימוש בהתאם לתקנות המקומיות.</li>
</ol>4. חשיפת עוברים לכימיקלים שייבדקו
<ol><li>בדוק את הכלים עם 72 עוברים ישנים HPF עבור עוברים מתים / לא בקעו ולהסיר אותם. אם אצווה של עוברים מכילה יותר מ -5% של ביצים שלא בקעו, להסיר את האצווה.</li>
	<li>מניחים 10 עוברים לכל צלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ ב-9 מ"ל של מדיום E3 (צלחת חשיפה).</li>
	<li>תייגו לוחות חשיפה עם שם התרכובת, ריכוז החשיפה ומספר ההעתקה. לדוגמה, "CdCl2 1 mg· L-1 01". כלול מספיק לוחות E3 בלבד ולוח בקרה ממס, במידת הצורך (ראה סעיף 5).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של תמיסת חשיפה לכל צלחת, החל מהריכוז הנמוך ביותר, וסובב את הצלחת. עבור תרכובות עם מסיסות נמוכה, החלף את כל 10 מ"ל הצלחת בתמיסת החשיפה (ראה שלב 3.2).</li>
	<li>רשום את הסדר הזמני שבו נוספו תמיסות מורכבות לעוברים.</li>
	<li>לדגור את הלוחות בתא לח באינקובטור ב 28.5 ° C במשך 48 שעות עד שהם מגיעים 120 hpf.</li>
</ol>5. ביצוע בדיקת בהלת הרטט
הערה: נתח את הלוחות באותו סדר שבו נרשם בשלב 4.5. כל ריצה צריכה לכלול לוחית בקרה E3.
<ol><li>הפעל את המחשב ואת התקן הרטט (נורית LED כחולה אמורה להיות דולקת).</li>
	<li>הכן את קובץ התצורה בגיליון אלקטרוני, כפי שניתן לראות באיור 1D ומצורף כקובץ משלים 1. רשום נתוני חשיפה עבור כל אחד מחמשת מיקומי הלוחות (תרכובת, ריכוז, שכפול).</li>
	<li>פתח את התוכנית ממשק משתמש כללי (GUI) (זמין בכתובת https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , מזהה פרוייקט 43215.)</li>
	<li>בדוק את תנועת המצלמה על ידי בחירת המיקומים השונים בתוכנית ממשק המשתמש הגרפי והתבוננות בתנועת המצלמה.</li>
	<li>הוציאו את לוחות הדגימה שיימדדו מהאינקובטור. הניחו את לוחות הדגימה על 5 המיקומים (ראו איור 1A, "רמקולים") והניחו לעוברים לשקוע במשך מספר דקות.</li>
	<li>לחץ על הקלט; ייפתח חלון לבחירת קובץ התצורה.</li>
	<li>בחר את קובץ התצורה המתאים שהוכן בשלב 5.2 עבור הפעלה זו.</li>
	<li>בדוק שתיאור המדגם תואם את הדגימות בכל מיקום (1-5).</li>
	<li>המדידה תתבצע באופן אוטומטי (10 שניות / מיקום). כאשר דופק הקול מוחל על ידי התוכנית, נורית מופעלת . הקלטה של 10 שניות לתנוחה מאפשרת להשיג מספיק נתונים כדי להעריך את מהירות השחייה ואת המרחק שעבר לפני ואחרי הפעלת הגירוי ומונעת התרגלות לגירויים הבאים.</li>
	<li>כאשר ההקלטה הושלמה, המצלמה חוזרת למצב 1 והתוכנה מתחילה לדחוס את הקבצים. במהלך תקופה זו, החלף את הדגימות בקבוצה הבאה שיש למדוד.</li>
	<li>עבור לשלב 5.2. כדי להקליט את הריצה הבאה.</li>
	<li>לאחר שכל הצלחות נמדדו, אספו את פתרונות החשיפה. השתמש במסננת כדי לשמור על העוברים.</li>
	<li>הרדימו את העוברים על ידי צינה מהירה באמבט קרח/איזופרופנול (5%).</li>
	<li>יש להיפטר מתמיסות החשיפה ומהעוברים המתים בהתאם לתקנות המקומיות.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את נתוני הווידאו באמצעות VirtualDub (1.10.4).</li>
	<li>סקור חזותית את מספר העוברים המגיבים לפולס הקול (כאשר נורית הבקרה דולקת).</li>
	<li>הזן נתונים בגיליון אלקטרוני. רשמו את שם התרכובת, את השכפול, את ריכוז התרכובת ואת אחוז העוברים חסרי התנועה בהתאם לתבנית המופיעה בקובץ משלים 2, הכולל את מערך הנתונים לדוגמה המוצג באיור 2C. הערה: לתבנית מבנה גמיש והיא מאפשרת בעיקר יישום נתונים של אורגניזמים אחרים ונקודות קצה. הוא מתאר את התגובות עבור כל ריכוז ומספק גם תיאורים של נקודות קצה, כמו גם הגדרות של הפרמטרים שנוצרו במידול תגובת הריכוז שלאחר מכן.</li>
	<li>בצע את ניתוח ריכוז הביצועים (BMC) באמצעות זרימת עבודה של KNIME (ניתוח KNIME 4.626) עם סקריפטים מוטבעים R (R גרסה 3.6., R-packages plotrix, drc ו- bmd 27,28). הערה: באופן עקרוני, ההערכה יכולה להתבצע גם ישירות ב-R. עם זאת, מטעמי נוחות וכדי לאפשר הערכה כשירות מבוסס אינטרנט, הניתוח אורגן בזרימת עבודה תואמת שרת KNIME. הפלט של זרימת העבודה של KNIME מסופק בקובץ משלים 3. לקבלת פרטים על הפרמטרים הסטטיסטיים שנוצרו על-ידי זרימת העבודה של KNIME, עיין בתבנית זו. הפרמטרים הסטטיסטיים להערכת מידת ההתאמה ותנאי הסף לקבלת ערכי BMC שנקבעו מוצגים בטבלה 1. זרימת העבודה של KNIME עצמה זמינה דרך GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). תגובת הריכוז מעוצבת באמצעות מודל לוגיסטי לוג-לוגיסטי בן 4 פרמטרים. ניתן לתקן שניים מהפרמטרים של התאמת העקומה. בדרך כלל, אחד יתקן את המקסימום ל -100 במקרה של נתוני אחוזים. במקרה שלא נצפו תופעות רקע, ניתן לתקן את המינימום ל -0%.</li>
</ol>

בדיקת בהלה להערכת רעילות בעובר דג זברה

אין לנו מה לחשוף.

אנו מציגים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים להערכת תרכובת כימית באמצעות מערך בדיקת בהלה של רטט עובר של דג זברה שנבנה בהתאמה אישית. זרימת העבודה מפיקה נתונים חזקים המאפשרים חישוב של פרמטרים אופייניים המציינים רעילות מורכבת, כגון ריכוז/מינון אמת מידה (BMC/BMD). המודולריות של ההתקנה מאפשרת התאמה לצרכים שונים של תפוקה ודרישות מקום. מכיוון שהמערכת עשויה מרכיבים בסיסיים זולים, לאחר התקנה פשוטה יחסית, היא מספקת אלטרנטיבה זולה למערכות מסחריות קיימות, המתוכננות בדרך כלל למספר סוגי בדיקות בבת אחת, מסתמכות על תוכנה קניינית ונשארות יקרות יחסית.
הן מערכות מסחריות אלה והן מערכות מותאמות אישית אחרות מאפשרות הערכה של עוברים בודדים או זחלים בלוחות מרובי בארות (למשל, 12-באר34, 16-באר32,35, 24-באר 20,33,36, 48-באר37, 96-באר 38,39,40,41,42 ואפילו באר 384 [כבאר 4x96]43), אבל ההגבלה המרחבית בבארות הופכת את הניתוח של כמה פרמטרים נתונים של תגובת המילוט (למשל, מרחק נסיעה) למאתגר יותר. יתר על כן, בחלק מהמערכים הללו, ההדמיה מוגבלת לתת-קבוצה של בארות הצלחת, מה שמקטין את התפוקה 36,39. הדמיה של עוברים בצלחות מאפשרת הערכה טובה יותר של פרמטרים של תגובת בריחה ומאפשרת רישום התנהגות של מספר עוברים בבת אחת (עד 30 בצלחת של 6 ס"מ, למשל). בדרך כלל, הדמיה מבוססת צלחת מוגבלת למנה אחת לכל ריצה 44,45,46,47,48 (חריגים מבצעים הדמיה במקביל על 6 מנות עם זחל אחד כל49 או על 4 זחלים ב 2 כלים מפוצלים50), חסרון שניתן לפתור על ידי עיצובים מקבילים כמו במקרה שלנו. סיכמנו כמה מאפיינים של המערכת ששימשה במחקר זה ובפתרונות מסחריים ומותאמים אישית אחרים בטבלה 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50, 51,52.
אחד היתרונות של השיטה הוא קריאה הלוכדת הן קטלניות והן שינויים התנהגותיים, אשר יכולים להגביר את הביצועים של הערכות רעילות. לדוגמה, בעוד שבדיקת רעילות חריפה של עובר דג זברה (FET)5 הוכחה כמנבאת רעילות בבדיקת רעילות חריפה של דג בוגר53 די טוב, דיוק החיזוי שלה השתפר על ידי הכללת קריאות התנהגותיות54. הסיבה לכך היא התמותה החלשה הנגרמת על ידי תרכובות נוירואקטיביות הנראות בעוברי דגים, כנראה בשל היעדר תסמונת הכשל הנשימתי הגורמת לרעילות מוגברת בדגים צעירים או בוגרים. עם זאת, ניתן לזהות נוירואקטיביות על ידי הערכת התנהגות. יתר על כן, קריאות התנהגותיות יכולות גם ללכוד השפעות מיוטוקסיות ואוטוטוקסיות, כמו גם השפעות רעילות אחרות, עדינות יותר, על הפיזיולוגיה, שהן תת-קטלניות אך משפיעות על הביצועים ההתנהגותיים של האורגניזם.
בעת ביצוע הבדיקה, קריטי להבטיח טיפול נכון בתרכובות, כמו גם שימוש באצווה מתפתחת הומוגנית של עוברי דגי זברה. לפיכך, שימוש בבקבוקוני זכוכית לאחסון תרכובות אמור למזער את הירידה בריכוזי כימיקלים, בעיקר תרכובות הידרופוביות, עקב ספיגה לחומר פלסטי. במקרה של תרכובות בעלות פוטנציאל ספיגה גבוה לפוליסטירן "פלסטיק", ניתן להשתמש גם בלוחות זכוכית לדגירה. ניקוי הביציות בצלחות תרבית הרקמה המשמשות לאיסוף והוצאת עוברים מתים הוא צעד קריטי להבטחת התפתחות תקינה. מהירות התפתחות תקינה חשובה, שכן עיכובים התפתחותיים עשויים להשפיע על בשלות הרשתות העצביות העומדות בבסיס ההתנהגות המוערכת14,33. כמו כן, כדי לאפשר השוואה של השפעות מורכבות, ביצים צריכות להיות מופקות מאותו זן שכן זנים שונים דווחו להציג פרופילים התנהגותיים שונים 38,55,56,57. במהלך החשיפה, חשוב לדגור על העוברים בתא לח על מנת למנוע אידוי יתר של תווך E3, אשר ישנה את הריכוזים הנבדקים.
יש לשלב בקרות E3 בכל ריצה על מנת לקבוע את רמת התגובה הבסיסית של קבוצת העוברים המסוימת המשמשת בסדרת הבדיקה. בדרך כלל, אנו מריצים צלחת אחת של פקדים לאורך כל קבוצה של 5 מדידות. כפי שמודגם באיור 2D, גישה זו מאפשרת גם זיהוי של אצוות עם תגובות תת-אופטימליות עקב עיכוב בהתפתחות או מסיבות אחרות, כגון השפעות רקע גנטיות. במקרה של חוסר תגובה בלתי צפוי לגירוי, היזהרו גם מכשל מתמר פוטנציאלי. בדרך כלל, תגובות הבהלה מראות התנהגות סיגמואידלית של ריכוז-תגובה המאפשרת התאמת עקומה באמצעות מודל לוגיסטי-לוג. עם זאת, במקרים נדירים עם תגובות דו-פאזיות, ייתכן שיהיה צורך להשתמש במודלים אחרים, כגון מודלים של גאוס או סידרגרין. הם זמינים בחבילות R drc ו- bdm27,28.
חוסר התגובה לגירוי הרטט עשוי להצביע פשוט על מוות של העוברים או על תפקודי חיים לקויים חמורים עקב ציטוטוקסיות כללית, אך עשוי גם לשקף רעילות ספציפית יותר המכוונת למעגלים עצביים של תפיסת גירוי, אינטגרציה ופלט מוטורי. השפעות מורכבות אפשריות אחרות הן הפרעה לממשק העצבי-שרירי או למבנה השרירים ולתפקודם. כדי להבחין בין האפשרויות הללו, יש צורך בבדיקות נוספות. לדוגמה, ניתן להעריך את השלמות המבנית של השרירים באמצעות בדיקת birefringency58,59, וקווים טרנסגניים זמינים להערכת תפקוד שרירי ועצבי60,61. עם זאת, נתוני הווידאו המוקלטים כבר מאפשרים ניתוח מפורט יותר של המורפולוגיה והתגובה ההתנהגותית של העוברים שיכולים לספק מידע נוסף ראשון. האם רק כיפוף C נפגע, או כל תנועתיות? האם עדיין קיימים שרידים של פעילות עצבית-שרירית, כפי שמעידים תנועות זנב חלשות או רועדות? האם התנהגויות משתנות כאלה הולכות יחד עם שינויים במורפולוגיה, כגון בצקת או עקמומיות גוף מוגברת? בנוסף, ניתן להעריך פרמטרים כגון זמן ההשהיה עד לכיפוף C או המרחק שעבר במהלך תגובת המילוט (ראו, למשל, הערה 44).
פרוטוקול הסינון המתואר כאן מאפשר הערכות רעילות מהירות וחזקות, עם הערך המוסף של זיהוי ספציפי של תרכובות נוירוטוקסיות לא קטלניות, אוטוטוקסיות ומיוטוקסיות. זרימת העבודה של הניתוח המסופקת קלה ליישום ומספקת קריאה חזקה. שינויים בפרוטוקולי הגירוי המשמשים בבדיקת בהלת הרטט שימשו לטיפול בהשפעות מורכבות גם על היבטים מורכבים יותר של התנהגות בהלה, כגון עיכוב דחף (PPI) 39,44 והרגלה32,33, וניתן להתאים אותם למערך הגירוי מבוסס המתמרים האלקטרודינמיים המשמש במחקר זה.
יישום עיקרי של מערכות סינון מבוססות תגובת בהלה הוא הערכת השפעות מורכבות במסכים כימיים, שהיא רלוונטית הן להערכת רעילות אנושית והן לפיתוח תרופות 1,4,62. יחד עם זאת, על ידי בדיקת שלבי החיים המוקדמים של אורגניזם ימי, התוצאות המתקבלות רלוונטיות ישירות להערכת סיכונים אקוטוקסיקולוגית 63,64. בנוסף, מערכות תגובת בהלה יכולות לשמש לפנוטיפ התנהגותי במסכים גנטיים 65,66,67,68,69. המערכת שלנו, הניתנת ליישום ולהתאמה בקלות, מספקת התקנה במחיר סביר למעבדות קטנות יותר המתכוונות לבצע פרויקטי סינון ספציפיים משלהן בתחומי יישום שונים אלה.

בשנים האחרונות, דגי זברה הפכו לאורגניזמי מודל פופולריים ביותר להערכת השפעות של תרכובות כימיות, המקיפים תחומי מחקר מפיתוח תרופות ועד טוקסיקולוגיה סביבתית1. כבעלי חוליות, דגי זברה חולקים היבטים רבים של המבנה הגנטי שלהם והפיזיולוגיה הכללית שלהם עם בני אדם 2,3. לכן, התוצאות המתקבלות במודל זה לעתים קרובות רלוונטיות ישירות לבריאות האדם. מספר תרופות מועמדות שנמצאות כעת בניסויים קליניים זוהו במסכים מורכבים באמצעות דגי זברה4.
הערכת רעילות היא יישום מרכזי אחד שבו בדיקות באמצעות שלבים עובריים של דגי זברה מעניינות. קיימות הנחיות בדיקה שונות של הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי (OECD) לשימוש בדגי זברה בבדיקות רעילות סביבתית 5,6. גודלם הקטן וההתפתחות המהירה של עוברי דגי זברה הופכים אותם למתאימים מאוד לגישות סינון בסולם תפוקה בינוני עד גבוה 1,3,4. נקודות קצה טוקסיקולוגיות הממוקדות על ידי מסכים כאלה כוללות מומים עובריים וקטלניות7, הפרעה אנדוקרינית8, רעילות איברים9, והערכות התנהגותיות המעידות על רעילות עצבית10,11. הבדיקות ההתנהגותיות אפשריות מכיוון שעוברים של דגי זברה מראים סוגים שונים של תגובות מוטוריות לגירויים שונים בהתאם לשלב התפתחותם. לדוגמה, עוברים של יום אחד לאחר ההפריה (dpf) מראים סלילת זנב ספונטנית12 ומגיבים לרצף של פולסי אור ברצף אופייני של תנועות, מה שמכונה תגובה פוטומוטורית (PMR)10. לאחר הבקיעה, המתרחשת בדרך כלל בסביבות 48-72 שעות לאחר ההפריה (hpf), עוברי Eleutheroembryos13 השוחים בחופשיות מפתחים בהדרגה תגובות בהלה ובריחה לגירויי רטט החל מסביבות 4 dpf14. תגובות אלה מאופיינות בכיפוף ייחודי לכיוון ההפוך לכיוון הגירוי (מה שנקרא C-bend או C-start), ואחריו כיפוף נגדי קטן יותר והתנהגות שחייה 14,15,16,17. יש לציין כי התנהגויות עובריות נשלטות על ידי מעגלים עצביים המשתמשים במערכות נוירוטרנסמיטרים שונות, מה שמאפשר לחקור השפעות של תרכובות כימיות המכוונות למערכות אלה. לדוגמה, בדיקת PMR חשפה את ההשפעות של תרכובות המפריעות לאיתות כולינרגי, אדרנרגי ודופמינרגי10, בעוד שתגובת הבהלה כוללת נוירונים כולינרגיים, גלוטמטרגיים וגליצינרגיים 16,18. יתר על כן, תרכובות הפוגעות בשרירים או בממשק העצבי-שרירי ישפיעו גם הן על התנהגויות אלה, כמו גם תרכובות רעילות לתאי השערה באוזן הפנימית/לרוחב19,20. התבוננות בהתנהגות המוטורית של דגי הזברה בתגובה לגירוי היא אפוא אמצעי מתאים להעריך לא רק רעילות עצבית אלא אוטוטוקסיות ומיוטוקסיות באותה מידה. ניקוד התנהגות מוטורית משמש גם כפרוקסי להערכת רעילות/קטלניות כללית מכיוון שעוברים מתים אינם זזים. לפיכך, התנהגויות תנועה עובריות מייצגות קריאה אינטגרטיבית לגישת בדיקת רעילות מהשורה הראשונה, המצביעה על השפעות קטלניות ותרכובות עצביות-שריריות במערך אחד. בהתחשב בכך eleutheroembryos כבר מסוגלים מטבוליזם תרכובות, הגישה עשויה גם לזהות את ההשפעות של תוצרי טרנספורמציה מטבולית 7,21,22. חשוב לציין, עוברים של דגי זברה אינם נחשבים לשלב החיים המוגנים על פי חלק מהחוקים להגנה על בעלי חיים עד לשלב ההזנה החופשית לאחר 120 HPF13. לכן, הם נחשבים כחלופה לניסויים רעילים בבעלי חיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg"> איור 1: הגדרת מערכת תגובת בהלה לרטט. (A) סקירה כללית של המערכת. צלחות עם עוברים שנחשפו לתרכובות הבדיקה ממוקמות על מערך המתמרים האלקטרודינמיים ("רמקולים"). המצלמה מועברת ברצף על ידי הכונן הליניארי מונחה החגורה למצב ההקלטה מעל מתמר המטרה. (B) תצוגה מפורטת של המתמר/רמקול עם צלחת תרבית רקמות מוכנסת למעלה. הלוחות מוארים מלמטה על ידי יריעת תאורת לד ב 4000-5000 לוקס. נורית LED ליד הרמקול נדלקת בזמן שהגירוי ניתן. (C) תמונת סטילס של וידאו שהוקלט על-ידי המצלמה בעת גירוי העוברים. (D) צילום מסך של קובץ התצורה. (ה) צילום מסך של ממשק תוכנת ההקלטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כאן, אנו מתארים פרוטוקול בדיקה להערכת השפעות מורכבות על תגובת בהלת הרטט באמצעות מכשיר בדיקה פשוט פנימי המבוסס על גירויי רטט שנוצרו על ידי מתמרים אלקטרודינמיים יחד עם הקלטת וידאו אוטומטית של מספר עוברים הנעים בחופשיות בצלחת תרבית רקמה23. המערכת מודולרית ומאפשרת הקלטה רציפה ממספר צלחות תרבית רקמה במקביל. במערך שנמצא בשימוש כיום, חמישה מתמרים אלקטרודינמיים מספקים גירוי רטט (500 הרץ, משך 1 אלפיות השנייה) לצלחות תרבית רקמה המכילות 20 עוברים שמונחים מעליהם (איור 1). הלוחות מוארים מלמטה ב 4000-5000 לוקס עם יריעות אור LED. נורת LED ליד כל מתמר מציינת תקופות של הפעלת גירוי, ואוסילוסקופ מציין צורות גל ותדירות הגירוי המופעל (לפרטים, ראה מקור 23). התנהגות העוברים נרשמת על ידי מצלמה במהירות גבוהה (טבלה של חומרים) ב 1000 פריימים לשנייה (fps), אשר מועבר מעל הרמקול היעד על ידי כונן ליניארי מונע חגורה. מהירות הקלטה זו נדרשת כדי לפתור באופן אמין את תגובת הבהלה. המערכת מספקת חלופה זולה וניתנת להתאמה אישית למערכות המסחריות הנוכחיות. תהליך העבודה המדויק המפורט להלן מבוצע כיום במסגרת יוזמת Precision Toxicology24 על מנת לקבוע תנאי חשיפה מתאימים לאיסוף נתוני OMICS מעוברים של דגי זברה שטופלו בקבוצה נבחרת של רעלים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 &#956;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z289744-1EA</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>XIMEA</td>
			<td>&#160;MQ013MG-ON USB 3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-3261</td>
			<td>Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 10 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3010.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 1000 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3050.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 20 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3020.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 200 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3030.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3902.500</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 6 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1175</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.5472.54</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system

פיתחנו מערכת סינון פשוטה להערכת רעילות עצבית-שרירית וכללית בעוברים של דגי זברה. המערכת המודולרית מורכבת ממתמרים אלקטרודינמיים שמעליהם ניתן להניח צלחות תרבית רקמה עם עוברים. ניתן לשלב מספר זוגות כאלה של תרבית רקמת רמקול. גירויי רטט הנוצרים על ידי המתמרים האלקטרודינמיים גורמים לתגובת בהלה ובריחה אופיינית בעוברים. כונן ליניארי מונע חגורה מציב ברצף מצלמה מעל כל רמקול כדי להקליט את תנועת העוברים. בדרך זו, שינויים בתגובת הבהלה עקב קטלניות או רעילות עצבית-שרירית של תרכובות כימיות ניתן לדמיין ולכמת. אנו מציגים דוגמה לזרימת העבודה לבדיקת תרכובות כימיות באמצעות מערכת זו, כולל הכנת עוברים ופתרונות טיפול, הפעלת מערכת הרישום וניתוח נתונים לחישוב ערכי ריכוז אמת מידה של תרכובות הפעילות בבדיקה. ההרכבה המודולרית המבוססת על רכיבים פשוטים הזמינים מסחרית הופכת מערכת זו לחסכונית וגמישה להתאמה לצרכים של תצורות מעבדה מסוימות ולמטרות סינון.

In recent years, zebrafish have become highly popular model organisms for the evaluation of chemical compound effects, encompassing research areas from drug development to environmental toxicology1. As vertebrates, zebrafish share many aspects of their genetic makeup and overall physiology with humans2,3. Therefore, results obtained in this model often are directly relevant to human health. Several drug candidates currently in clinical trials have been identified in compound screens using zebrafish4.
Toxicity assessment is one major application where tests using zebrafish embryonic stages are of interest. Various Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guidelines exist for the use of zebrafish in environmental toxicity testing5,6. The small size and rapid development of zebrafish embryos make them highly suitable for screening approaches on a medium to high throughput scale1,3,4. Toxicological endpoints targeted by such screens include embryonic malformations and lethality7, endocrine disruption8, organ toxicity9, and behavioral assessments indicative of neural toxicity10,11. The behavioral assays are possible because zebrafish embryos show various types of locomotor responses to different stimuli depending on their stage of development. For example, 1 day post fertilization (dpf) embryos show spontaneous tail coiling12 and respond to a sequence of light pulses with a typical sequence of movements, the so-called photomotor response (PMR)10. After hatching, typically occurring around 48-72 hours post fertilization (hpf), the freely swimming eleutheroembryos13 gradually develop startle and escape responses to vibrational stimuli starting around 4 dpf14. These responses are characterized by a distinctive bend to the direction opposite the direction of the stimulus (the so-called C-bend or C-start), which is followed by a smaller counter bend and swimming behavior14,15,16,17. Notably, embryonic behaviors are governed by neural circuits using various neurotransmitter systems, allowing for probing chemical compound effects targeting these systems. For example, the PMR assay revealed the effects of compounds interfering with cholinergic, adrenergic, and dopaminergic signaling10, while the startle response involves cholinergic, glutamatergic, and glycinergic neurons16,18. Furthermore, compounds that damage the muscles or the neuro-muscular interface will also affect these behaviors, as will compounds toxic to the inner ear/lateral line hair cells19,20. Observing zebrafish locomotor behavior in response to a stimulus is thus a suitable means to assess not only neurotoxicity but equally ototoxicity and myotoxicity. Scoring locomotor behavior also serves as a proxy for general toxicity/lethality assessment since dead embryos do not move. Thereby, embryonic locomotion behaviors represent an integrative readout for a first-tier toxicity screening approach, which indicates lethal and neuromuscular compound effects in one setup. Given that the eleutheroembryos are already capable of metabolizing compounds, the approach may also detect the effects of metabolic transformation products7,21,22. Importantly, zebrafish embryos are not considered as protected life stage under some animal protection legislations until the stage of free feeding after 120 hpf13. Therefore, they are regarded as an alternative to animal toxicity testing.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg" /> 
Figure 1: Vibration startle response system setup. (A) Overview of the system. Plates with embryos exposed to the test compounds are placed on the electrodynamic transducer array (&#34;loudspeakers&#34;). The camera is sequentially moved by the belt-driven linear drive into the recording position above the targeted transducer. (B) Detailed view of the transducer/loudspeaker with tissue culture dish inserted on top. The plates are illuminated from below by an LED light sheet at 4000-5000 lux. An LED light next to the speaker lights up while the stimulus is given. (C) Still image of video recorded by the camera upon stimulation of the embryos. (D) Screenshot of the configuration file. (E) Screenshot of the recording software interface. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Here, we describe a testing protocol for the evaluation of compound effects on the vibration startle response using an in-house build simple testing device based on vibration stimuli generated by electrodynamic transducers coupled with an automated video recording of several freely moving embryos in a tissue culture dish23. The system is modular and allows for sequential recording from several tissue culture dishes in parallel. In the setup currently used, five electrodynamic transducers provide a vibrational stimulus (500 Hz, duration 1 ms) to tissue culture dishes containing 20 embryos placed on top of them (Figure 1). The plates are illuminated from below at 4000-5000 lux with LED light sheets. An LED light next to each transducer indicates periods of stimulus application, and an oscilloscope indicates waveforms and frequency of the applied stimulus (for details, see Ref. 23). The behavior of the embryos is recorded by a high-speed camera (Table of Materials) at 1000 frames per second (fps), which is moved above the targeted speaker by a belt-driven linear drive. This recording speed is required to reliably resolve the startle response. The system provides a low-cost, individually adaptable alternative to current commercial systems. The precise workflow detailed below is currently performed in the framework of the Precision Toxicology initiative24 in order to determine suitable exposure conditions for OMICS data acquisition from zebrafish embryos treated with a selected set of toxicants.

מחבר באור הזרקורים: בדיקת רעילות בתפוקה גבוהה באמצעות בדיקת תגובת בהלה של עובר דג זברה

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

When screening chemicals for toxicity, a current experimental challenge is the determination of toxic effects in vivo, taking into account the complexity of a whole organism, and to do this in a rapid high-throughput manner. By using a behavioral readout that monitors the escape response of zebrafish embryos to a vibration stimulus, our system allows us to identify compounds that interfere with neural or muscular function. Because dead embryos don't move, we also capture compounds that cause lethality by unspecific toxicity.The system we present can be built for a modest price and is customizable. It is also easy to maintain and all pieces can be replaced. We are currently employing the startle assay system within the PrecisionTox Consortium to determine a chemical compound dose for OMICS data acquisition.The data are generated across five model organisms and human cell lines. They will be used to derive toxicity pathways and biomarkers for human toxicity prediction.

איור 2A מראה את אחוז העוברים חסרי התנועה ב-48 זוגות של עוברים פראיים לא מטופלים (זן AB2O2). בממוצע, 14.33% מהעוברים מסוג בר לא מטופלים אינם מגיבים לגירוי הרטט. ב-4 מצמדים אחוז הזחלים הלא תנועתיים הגיע ל-50%, אך ב-75% מהזחלים חסרי התנועה אחוז הזחלים הלא תנועתיים היה נמוך מ-20%.
איור 2B,C מציג דוגמה לחישוב טיפוסי של ריכוז/מינון אמת מידה (BMC/BMD29,30) עבור השפעות מורכבות על תנועתיות עם זרימת העבודה של בדיקת בהלת רטט, כפי שמבוצע כעת בקונסורציוםPrecisionTox 24. ערכי BMC10, BMC25 ו-BMC50 תואמים לריכוזים שבהם 10%, 25% ו-50% מהעוברים מראים רמות חוסר תנועתיות גבוהות יותר מהרקע, בהתאמה. רק עוברים חסרי תנועה לחלוטין נכללים בחישוב הזה, לא אלה שעדיין מראים תגובות חלקיות, כמו למשל רק כיפוף C ללא שחיית בריחה לאחר מכן או רק תנועות זנב (איור 2B). העוברים נחשפו ל-8 ריכוזים של מעכב תעלת הנתרן טריקאין מתאן-סולפונט, המשמש לעתים קרובות להרדמת דגים31. הנתונים מצביעים על רמת רקע של כ-25% חוסר תנועתיות בתגובה לגירוי הרטט. החל מ 1% tricaine, תנועתיות מופחתת ולאחר מכן מפסיק מעל 2.5%. תהליך העבודה של KNIME מחשב את BMC50 כ-164.9 מיקרומטר, המתאים ל-1.07% טריקאין ולרמת חוסר תנועתיות של 75% (איור 2C). מרווחי בר-סמך קטנים של 95% (מסומנים על ידי הגוונים האפורים בעקומה) מצביעים על יכולת שחזור איתנה של ערכי התנועתיות בבדיקה זו.
איור 2D מציג דוגמה לריצת בדיקה תת-אופטימלית, שאין להשתמש בנתונים שלה לחישובי BMC. מוצגות חמש קבוצות ביקורת שטופלו ב-E3 עם עוברים שונים שמקורם באותו מצמד (AB2O2 [זן מסוג פרא] משכפל 1-5). רק הקבוצה הראשונה הראתה תגובה כמעט נורמלית, והראתה חוסר תנועתיות של כ-25% שעולה בקנה אחד עם ערכי ספרות32 ואלה שהתקבלו בבדיקה המתוארת כאן, כפי שמוצג באיור 2A, בעוד שכל שאר הקבוצות מראות תגובות התנהגותיות מופחתות ו/או חלקיות (למשל, מראה רק כיפוף C שלא מלווה בפעילות שחייה, או תנועתיות ללא כיפוף C ברור בהתחלה). תגובה כזו עלולה להתרחש כאשר העוברים אינם מתפתחים כראוי ונמצאים במצב לא בשל עקב עיכוב התפתחותי, המשפיע על חוסנה של תגובת הבהלה14,33.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig02v2.jpg"> איור 2: דוגמה לתוצאה טיפוסית, כולל חישוב מינון אמות מידה. (A) אחוז העוברים שאינם מגיבים לאחר דופק הקול עבור זחלים לא מטופלים מסוג בר עבור 48 מצמדים (n = 10 לכל מצמד). הממוצע (14.33%) וסטיית התקן (±16.19%) מסומנים באדום. (B) הערכת התנהגות תגובת הבהלה של עוברים (n=20 לכל מצב) שטופלו בריכוז המצוין של טריקאין בתווך E3 או ב-E3 בלבד כביקורת. ההתנהגות מסווגת לפי ערכת הצבעים והקריקטורות המצוינות מימין לגרף, כאשר כל עובר מוקצה רק לאחד מהסוגים הבאים: "בלתי ניתן לתנועה": העובר אינו מראה כל תנועה; "זנב זז": העובר מראה תנועת זנב, אך לא כיפוף C ולא התנהגות שחייה; "תנועתי": העובר מראה תנועת שחייה, אך ללא כיפוף C בתגובה לגירוי הרטט; "C-bend only": העובר מראה C-bend, אבל לא לברוח משחייה; "C-bend + motile": העובר מראה התנהגות אופיינית לכיפוף C ואחריה שחיית בריחה (תגובת הבהלה המלאה האופיינית). ההתנהגויות השונות מוצגות כאחוז מכלל העוברים בכל טיפול. (C) גרף חישוב BMC שנוצר על ידי תהליך העבודה של KNIME, המציין את אחוז העוברים "הבלתי נעים" עבור כל ריכוז טיפול. קווים כחולים, אדומים ושחורים מציינים את הערכים BMC10, BMC25 ו-BMC50, כלומר הריכוזים שבהם 10%, 25% ו-50% מהעוברים מראים רמות חוסר תנועתיות גבוהות יותר מהרקע, בהתאמה. (ד) דוגמה להפעלת בדיקה שנמחקה. מוצגות חמש ריצות בקרה שטופלו ב-E3 עם עוברים שונים מסוג AB2O2 שמקורם באותו מצמד (משוכפלים 1-5). רק שכפול 1 מראה תגובה כמעט נורמלית, בעוד שהעוברים של שאר הריצות אינם מראים את תגובת השחייה האופיינית לכיפוף C + בריחה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig02largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: פרמטרים סטטיסטיים להערכת מידת ההתאמה ותנאי הסף לקבלת ערכי BMC שנקבעו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: מאפיינים של מבחר מערכות בדיקת תגובת בהלה רטט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: תבנית Excel עבור קובץ תצורה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: תבנית קלט KNIME עם ערכת נתונים לדוגמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: דוגמה לקובץ פלט KNIME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System at JoVE.com

אנו מתארים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים של מערכת סינון להערכת רעילות של תרכובות כימיות בהתבסס על תגובת הבהלה של רטט עובר דג הזברה. המערכת מתעדת את תנועותיהם של עוברי דגי זברה בחשיפה לגירוי רטט ומאפשרת הערכה משולבת של רעילות/קטלניות כללית ורעילות עצבית-שרירית.

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

בעת סינון כימיקלים לרעילות, אתגר ניסיוני נוכחי הוא קביעת ההשפעות הרעילות in vivo, תוך התחשבות במורכבות של אורגניזם שלם, ולעשות זאת באופן מהיר בתפוקה גבוהה. על ידי שימוש בקריאה התנהגותית המנטרת את תגובת הבריחה של עוברי דגי זברה לגירוי רטט, המערכת שלנו מאפשרת לנו לזהות תרכובות המפריעות לתפקוד עצבי או שרירי. מכיוון שעוברים מתים אינם זזים, אנו לוכדים גם תרכובות הגורמות לקטלניות על ידי רעילות לא ספציפית.המערכת שאנו מציגים ניתנת לבנייה במחיר צנוע וניתנת להתאמה אישית. הוא גם קל לתחזוקה וניתן להחליף את כל החלקים. אנו משתמשים כעת במערכת בדיקת הבהלה בתוך קונסורציום PrecisionTox כדי לקבוע מינון תרכובת כימית לרכישת נתוני OMICS.הנתונים מופקים על פני חמישה אורגניזמים מודל וקווי תאים אנושיים. הם ישמשו להפקת מסלולי רעילות וסמנים ביולוגיים לחיזוי רעילות אנושית.

evaluating-toxicity-chemicals-using-zebrafish-vibration-startle

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

811 Views.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord. בעת סינון כימיקלים לרעילות, אתגר ניסיוני נוכחי הוא קביעת ההשפעות הרעילות in vivo, תוך התחשבות במורכבות של אורגניזם שלם, ולעשות זאת באופן מהיר בתפוקה גבוהה. על ידי שימוש בקריאה התנהגותית המנטרת את תגובת הבריחה של עוברי דגי זברה לגירוי רטט, המערכת שלנו מאפשרת לנו לזהות תרכובות ה...

Video: מחבר באור הזרקורים: בדיקת רעילות בתפוקה גבוהה באמצעות בדיקת תגובת בהלה של עובר דג זברה

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.