Мы благодарим г-жа Паула Рой за отличную хозяйства рыба, и Стив Ekker для рода даром pDB600 плазмиды. Эти исследования были профинансированы за счет гранта в СФ от NHGRI.

1. Выбор и клонирования сохраняется последовательностей для тестирования <ol><li> Сначала нужно определить потенциальные регуляторные последовательности для функционального тестирования. Мы полагаемся на эволюционной сохранения последовательности в качестве критерия для выбора последовательности и наиболее часто используют алгоритм PhastCons, которая доступна в качестве трека на УСК браузер генома (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Однако Есть много других доступных алгоритмов для оценки последовательности сохранения разных видов. </li><li> После того как мы выбрали наши последовательности, мы разрабатываем праймеров для амплификации каждой последовательности из геномной ДНК. Грунтовка должна быть выбрана для усиления консервативной области плюс 30 или более пар оснований с обеих сторон. </li><li> Для усиления подобранных последовательностей мы используем Takara Л. TaqTM системы. Другие полимераз будет работать, но важно использовать смесь, которая включает в себя фермента с корректура возможность, чтобы свести к минимуму вероятность ошибок, внесенных во время усиления. Мы проверяем ампликона размер помощью электрофореза в агарозном геле. </li><li> Мы используем ПЦР 8/GW/TOPO Т. А. Клонирование Kit (Invitrogen) для клонирования ПЦР-продукта в запись вектора, содержащего attL сайты рекомбинации, для создания клона шлюз записи. Клонирование реакция является более эффективным с свежий продукт ПЦР, так что лучше выполнять клонирование в день ПЦР. Преобразование в штаммов DH5α осуществляется с последующим отбором сопротивление спектиномицину. </li><li> Мы проверяем продукт клонирования ТА на переваривание ~ 500ng плазмиды с EcoRI для освобождения вставки, и подтвердить размер вставки помощью электрофореза в агарозном геле. Мы рекомендовали последовательности для проверки последовательности вставки и ориентации; праймеров для амплификации могут быть также использованы для секвенирования. </li><li> С момента вступления клон, некодирующих сохраняется последовательность курсировали рекомбинации LR нашим шлюз готовый вектор назначения, pGW_cfosGFP1, используя шлюз LR Clonase II фермента Mix (Invitrogen). Преобразование в штаммов DH5α осуществляется с последующим отбором устойчивости к ампициллину. </li><li> Мы проверяем продукт рекомбинации LR на переваривание ~ 500ng плазмиды с EcoRV выпустить вставки, и подтвердить размер вставки помощью электрофореза в агарозном геле. После точного клона была идентифицирована, мы готовим плазмидой ДНК с использованием Qiagen HiSpeed ​​® плазмиды Midi Kit. Мы также очистить плазмиды использованием ПЦР Очистка QIAquick Kit, согласно протоколам производителя, и элюции ДНК с 30 мкл РНКазы воду бесплатно. Плазмиды разбавляют до концентрации 125 нг / мкл и хранили при 4 ° С до инъекций. </li><li> РНК кодирования функциональных Tol2 транспозазы фермента транскрибируется в пробирке из pDB600 plasmid2. Мы очищаем плазмиды использованием Qiagen Midi-Prep комплект, то линеаризацию 10-20 мкг с XbaI. МРНК, синтез осуществляется следующим mMESSAGE mMACHINE Kit протокол (Амбион). </li><li> Мы очищаем и выпадают в осадок РНК в соответствии с комплектом инструкций. Мы ресуспендирования РНК в конечной концентрации ~ 1μg/μl, или 20 мкл для одной реакции, в РНКазы свободной воды, и количественно УФ-спектрофотометрии. Мы также анализируем ~ 1 мкг РНК с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы проверить, насколько полно транскрипции длины. Хотя стандартный TAE или TBE геля достаточно для этого анализа, денатурирующих образец буфера входит в транскрипции комплект должен использоваться в соответствии с комплектом инструкций. </li><li> Мы проверяем каждую новую партию транспозазы РНК на эффективность путем выполнения инъекций с известными плазмиды (рис. 1). После проверки, РНК разделяется на небольшие порции и хранят при температуре -80 ° С, чтобы избежать повторного оттаивания и замораживания отдельных аликвоты. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Данио рерио эмбрион вводят с помощью мыши Sox10 усилитель в качестве контроля. (Топ) Светлое изображение (внизу) GFP флуоресценции изображение. Каждая новая партия транспозазы РНК проверяется на эффективность. </li></ol> 2. Микроинъекции данио эмбрионов для мозаики трансгенных анализ <ol><li> Тянем иглы для микроинъекции от 1,2 мм Диаметр нити капиллярной стекла на Саттер Р-97 Съемник микропипетки, с программы, предназначенной для выхода сильной наконечник с довольно резким конусом проникнуть нетронутыми chorions. Разобьем подсказки руку под стереомикроскопа с внешним диаметром около 15 мкм, используя чистые лезвия бритвы и микрометра слайда. Иглы может быть сделано за день до инъекции, и хранится в закрытой проведение блюдо, чтобы содержать в чистоте. </li><li> Мы сохраняем данио на обычном свете темно цикла, с 14 часов света при стандартных conditions3. За день до проведения микроинъекции, мы создали для рыбы приурочено вязки в небольших резервуарах разведения, каждая из которых состоит из базы танк, щелевые вставки и пластиковой крышкой. Мы размещаем три самки или два самца на тАНК параллельными рядами. </li><li> Утром микроинъекции, вскоре после того света цикл начинается, мы начинаем объединение мужчин и женщин в чистую систему обработанной воды для производства яиц. Важно, чтобы проверить рыбу часто, и собирать яйца в течение нескольких минут после укладки, чтобы получить хорошо синхронизированы партиями. Производство яиц может поддерживаться в течение двух-трех часов, продолжая совмещать свежих групп рыб в первой половине дня. </li><li> С широким отверстием, 5 1 / 4 &quot;стеклянной пипетки Пастера оснащен лампой латекс, мы сортируем собранные эмбрионов в 60 х 15 мм чашки Петри, частично заполненную эмбрионов Medium2, в группах из 50 эмбрионов, и отметьте время собранные на Крышка каждого блюда. </li><li> Как только рыба начала укладки, мы готовим свежие инъекционного раствора путем смешивания следующих в микроцентрифуге пробирку на льду: <table border="1"><tbody><tr><td> Компонент </td><td></td></tr><tr><td> Транспозонов плазмиды акций (125ng/μl) </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> Транспозазы РНК акций (175ng/μl) </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> Фенол фондовом красный (2% в H 2 O) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> РНКазы свободной воды </td><td> 2.5μl </td></tr></tbody></table> Инъекции иглами заложены в проведении блюд и заполнены с помощью пипетки 500 Нл капель раствора для инъекций на широком конце каждой иглы. После жидкости обращается на кончике через капиллярное действие, дополнительное решение может быть добавлена ​​в общей сложности 1,5-2 мкл. Мы готовим по крайней мере двумя иглами для каждой инъекции раствора. </li><li> Заполнен иглы загружается в ручной иглы обладатель Пневматические Pico-насоса или аналогичной давления инжектор, настроить и подключить к N2 бак в соответствии с инструкциями производителя. Мы калибровки инъекции объемы путем измерения диаметра капли выбрасываются в минеральное масло на микрометр слайда. Как правило, время впрыска 120 мс при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм даст капли около 1 п, но небольшие изменения в иглу диаметром повлияет на эти параметры и калибровка может потребоваться между иглами. </li><li> Инъекции выполняются под стереомикроскопа на 6-10-кратным увеличением. Мы используем пару тонких щипцов для хранения эмбрионов на месте, нажмите инъекционной иглой с постоянным давлением через хориона и в желток эмбрион на одну клетку или в начале два клеточной стадии. В идеале, мы позиции иглы в желтке чуть ниже бластомеров. Приблизительно 1 п о раствор для инъекций исключен и иглы отозвано. Для каждой конструкции мы вводим ≥ 200 эмбрионов. Это также очень важно, для каждого сцепления эмбрионов собираются, чтобы сохранить блюдо uninjected эмбрионов контроля. </li><li> После инъекции завершены мы сортируем эмбрионы, удалив неоплодотворенные яйца, повреждения эмбриона, и не инъекциями (эмбрионы, без фенола красного бластомеров). Затем мы инкубировать эмбрионов в зачаточном состоянии среды при 28,5 ° С до подходящее время для наблюдений. </li></ol> 3. Анализ мозаичные узоры выражение <ol><li> После соответствующего времени инкубации, мы исследуем вводят эмбрионов для флуоресценции. Времени зависит от нормальной картины выражение эндогенный ген данио, но мы обычно смотрим ежедневно через первые 5 дней после оплодотворения. </li><li> Мы рассматриваем эмбрионов для флуоресценции от macroscope Olympus MVX10 приспособлены для epifluorescence, но любой подобный микроскоп способны низкой изображений власть будет работать. Если Есть большое количество эмбрионов, которые умерли или ненормально развитой в первый день, посмотрите на uninjected контроль за это сцепление, чтобы увидеть, если они выглядят нормально. Если элементы управления выглядят нормально, наиболее распространенной проблемой является недостаточная чистота вводили ДНК. Кроме того, эмбрионы на ранних стадиях чувствительны к общей сумме вводят плазмиды, так что вполне возможно, что количественное был неточным и слишком много ДНК вводили. </li><li> При рассмотрении эмбрионов, имейте в виду, что все они будут мозаика для вводили конструкцию. Надо будет посмотреть внимательно на все эмбрионов, особенно если ожидается области выражении невелик. Также помните, что выражение может быть динамичной, сильной флуоресценции в 1 день может исчезнуть к 2-й день, и эмбрионов для выражения отрицательного первые 3 дня может показать что-то на 4-й день. </li><li> Мы выбираем некоторые эмбрионы с более обширными выражения, и использовать их для документа шаблон флуоресценции photomicroscopy. После 5 дней наблюдений, эмбрионы должны быть возвращены в учреждение и вырос, как акции. Через несколько месяцев, взрослые могут пройти обследование на зародышевой линии передачи трансгенов. </li></ol> 4. Результаты Мы видим широкие Variety узоров и уровень экспрессии, в зависимости от элементов усилителя анализируются. Мы, как правило, заинтересованы в ткани очень конкретных моделей выражения, и часто с акцентом на гены выражены в скелете. и часто с акцентом на гены выражены в скелете. На рисунке 2 показаны примеры мозаичные узоры выражение мы наблюдали в нашей вводят эмбрионы, с усилителями регулирующие выражение в хрящи и кости. Наконец, значительная часть протестированных последовательностей не регулируют ткани конкретное выражение. Для них мы чаще всего видим очень мало флуоресценции, возможно, несколько разрозненных ячеек в зародыше. Реже, мы могли бы видеть флуоресценции, но только в двух общих мест для эктопической экспрессии, эпидермиса и скелетных мышц (рис. 3). <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Пример хрящевой и костной выражения, наблюдаемую в вводили эмбрионов. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Существует незначительная связь между расположение относительной усилитель для генов и регуляции экспрессии. Значительную часть протестированных последовательностей не регулируют ткани конкретное выражение. Они часто имеют очень мало флуоресценции, или может иметь две общие сайты для внематочная выражение: эпидермис и скелетных мышцах. (Вверху) Светлое изображение (внизу) GFP флуоресценции изображение.

<ol>
	<li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish.">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li><li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li></ol>

Мы показали, подход, используемый в нашей лаборатории для эффективного анализа потенциальных усилителей использованием данио трансгенез. Чаще всего мы используем этот подход, чтобы искать тканеспецифические усилители связанные с человеческими генами. Несмотря на отсутствие очевидн...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Takara LA Taq</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>RR02M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K2500-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gateway LR Clonase II enzyme Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11791-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DH5&alpha;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12535-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DB3.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11782-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAquick PCR Purification Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic PicoPump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mosaic zebrafish transgenesis for evaluating enhancer sequences

Завершение геноме человека, а также многих других видов, высветил проблемы приписывая определенную функцию, не кодирующих последовательностей. Один известный функция осуществляется без кодирования долю генома состоит в регулировании транскрипции генов, однако, Есть нет эффективных методов широко предсказать цис-регуляторных элементов от первичной последовательности ДНК. Мы разработали эффективный протокол функционально оценки потенциальных цис-регуляторных элементов через данио трансгенез. Наш подход дает значительные преимущества по сравнению с клеточной культуры, основанной методы развивающих важные гены, так как он содержит информацию о пространственной и временной регуляции генов. С другой стороны, это быстрее и дешевле, чем аналогичные опыты на трансгенных мышах, и мы регулярно применять ее к последовательности изолированы от человеческого генома. Здесь мы показываем, наш подход к выбору элементов для тестирования на основе сохранения последовательности и наш протокол для клонирования последовательностей и microinjecting их в данио эмбрионов.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences at JoVE.com

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Мы демонстрируем наш подход к поиску потенциальных элементов усилителя от умственно регулируемых генов и оценки их функции через мозаику трансгенез рыбок данио.

Мозаика данио рерио трансгенез для оценки Enhancer Последовательности

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-evaluating-enhancer-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Views.  University of Pennsylvania. Мы демонстрируем наш подход к поиску потенциальных элементов усилителя от умственно регулируемых генов и оценки их функции через мозаику трансгенез рыбок данио.

Video: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Данио рерио желудочков мозга инъекций

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Восстанавливающий взрослых данио рерио хвостового плавника

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Лазерная нанесенные травмы рыбок данио эмбриональных скелетных мышц

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Томатный / GFP-ФЛП / FRT Метод живых изображений мозаики взрослых<em&gt; Дрозофилы</em&gt; клетки фоторецепторов

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

Разделение сперматогенного Типы клеток с использованием STA-PUT скорости осаждения

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Автоматизированный анализ динамических Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в последовательности изображений

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

В Vivo поверхности Электрокардиография для взрослых зебрафиш

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...