Для начала поместите формы для микролунок PDMS, раствор для промывки, препятствующий прилипанию, и необходимую лабораторную одежду в капюшон для культуры тканей. Чтобы промыть формы для микролунок PDMS, используйте пипетку объемом 1 000 микролитров, чтобы добавить 300 микролитров раствора для промывки, препятствующей прилипанию, в каждую лунку. Затем центрифугируйте планшет 1, 620 г в течение трех минут.
Используйте вакуумный насос и пипетку Пастера для аспирации раствора. Далее поместите в микролунки 500 микролитров клеточной суспензии нужной концентрации и центрифугируйте планшет при 1,620 G в течение трех минут. Поместите планшет во влажный инкубатор, чтобы обеспечить образование сфероидов.
Чтобы собрать фероиды, с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров плотно добавьте в каждую лунку по 500 микролитров полной среды. Пипеткой добавляйте добавленную среду вверх и вниз в каждом квадранте три-четыре раза, чтобы выбить спермоиды. Затем с помощью пипетки аккуратно отасуньте среду, содержащую сфероиды, в микроцентрифужную пробирку.
Перенесите 50 микролитров стероидной суспензии в микроцентрифужную пробирку. Затем последовательно добавьте в него 4-Arm PEG акрилат и PEG дитиол. Смешайте полученный раствор, пипетируя его вверх и вниз около 10 раз.
Чтобы получить 100 микролитров 10% весового раствора гидрогелевого предшественника PEG, пипетку 20 микролитров раствора гелевого предшественника между двумя стеклянными предметными стеклами, покрытыми парапленкой, разделенными силиконовыми прокладками размером в один миллиметр, и инкубируйте предметные стекла с раствором гелевого предшественника для обеспечения гелеобразования. После завершения гелеобразования гидрогеля с помощью шпателя аккуратно снимите гели с отделенных стекол. Поместите по одному гелю на лунку в 24-луночный планшет так, чтобы поверхность, содержащая сфероиды, была обращена вверх.
Добавьте 500 микролитров готовой среды в каждую лунку, чтобы полностью погрузить гидрогель. Поместите многолуночный планшет во влажный инкубатор для культивирования клеток. Описанный метод с использованием форм с микролунками привел к образованию сфероидов со сферической формой и жестко контролируемой полидисперсностью.
Для сфероидов с 3300 ячейками на микролунку средний размер сфероида составлял около 250 микрон, а круговость была больше 0,8, учитывая значение 1 как идеальную сферу. Диаметры сфероидов зависели от размера микролунки и количества ячеек в микролунке.
