Создание кимографа и измерение отдельных событий переноса у живого червя Caenorhabditis elegans

Для начала запишите таймлапс эндогенного GFP Rab3 в асинаптической зоне аксона DA9 у живого Caenorhabditis elegans. Импортируйте файл данных таймлапса на Фиджи. Затем проверьте наличие движения или небольшого смещения животного или сегмента аксона во время получения изображения.

Используйте плагин StackReg с опцией трансформации твердого тела для коррекции любого движения или дрифта. Используйте инструмент «Сегментированная линия» и отрегулируйте ширину линии в соответствии с диаметром аксона. Дважды щелкните левой кнопкой мыши по значку сегментированной линии, чтобы провести линию вдоль сегмента аксона для анализа.

Теперь с помощью фиджийского плагина KymoResliceWide сгенерируйте кимограф, установив максимальное значение интенсивности по ширине линии в настройках его параметра. С помощью инструмента прямой линии отслеживайте события переноса в кимографе. отслеживайте отдельные события транспорта и сохраняйте каждую строку в менеджере ROI.

На Фиджи выберите параметры измерения, такие как площадь, ограничивающий прямоугольник, среднее значение серого и диаметр Ферета. Затем вставьте таблицу результатов в таблицу для расчета. Умножьте ширину на разрешение камеры, чтобы получить длину пробега в микрометрах.

Чтобы определить продолжительность события движения, умножьте высоту на время сбора данных между последовательными временными точками. Рассчитывайте время паузы как продолжительность бега между двумя последовательными движениями, когда скорость равна нулю. Нормализуйте общее количество событий в соответствии с общей длиной кимографа по количеству событий в минуту и сегменту длины аксона.

С помощью инструмента Угол хорька классифицируйте события на антероградный и ретроградный транспорт. Для кимографов, полученных путем проведения сегментированной линии от проксимальнее к дистальной, используйте угол Ферета для определения направленности каждого события.