Способность количественной оценки изменений в морфологии тканей и органелл имеет важное значение для понимания функции генов, а также влияние генетических мутаций. Наши протоколы объясняют, как свободно доступное программное обеспечение может быть использовано для неимовесивной оценки морфологии синапсов, мышц и митохондрий в нематоде, C.elegans. Многие предыдущие исследования опирались на качественные методы сравнения морфологических изменений.
Тем не менее, они могут быть проблематичными, поскольку они не могут захватить тонкие фенотипические различия, может чрезмерно и недооценивать изменения, и оцениваются субъективно. Наши количественные методы обеспечивают более надежные и менее предвзятые средства для оценки морфологических изменений. Эти методы могут быть легко использованы для изучения морфологических изменений в других клеточных структурах или модельных организмах для определения функции генов и последствий связанных с болезнью мутаций.
Начните с подготовки слайдов для визуализации. Поместите каплю расплавленной агарозы на слайд микроскопа и немедленно нажмите вниз капельку с другой слайд микроскопа, мягко уплощая агарозу. Оставьте агарозу высохнуть в течение одной минуты, затем тщательно разделите две горки и оставьте затвердевую площадку на одном из слайдов.
Поместите слайд на стадии микроскопа и добавьте 5-10-миллилитровую каплю анестезии в центр агарозной площадки. Используйте теплостерилизуемый выбор, чтобы быстро передать от 10 до 15 животных из фондовой пластины в обезболивающее капельное, прежде чем раствор высохнет. Затем нанесите крышку, позиционирование его чуть выше агарозы площадку и аккуратно опустив его вниз.
Изображение синаптических областей с помощью конфокального микроскопа, сканирующего линию, в сочетании с 488 и 552 нанометровых оптически накачанных полупроводниковых диодных лазеров и оснащено программным обеспечением для захвата изображений. После обнаружения червей, переключиться на 40X увеличение и применить погружение среды. Визуальный синаптической области, захватывающие флюорофоры с 552 нанометровый лазер, 1% мощности для флюорофора tagRFP, и 488 нанометров, 2% мощности для фторфора GFP.
Захват изображения с помощью гибридного фотодетектора и установить выгоды для предотвращения чрезмерного воздействия флюорофоров. Соберите изображения стека, чтобы покрыть весь синапс, используя оптимальный размер шага в зависимости от цели. Для анализа синаптической области начните с загрузки изображений в программное обеспечение CellProfiler 3.1.5.
Настройка модуля NameAndType и определение синаптической области по определению руки с помощью диффузного tagRFP, выраженного из трансгена UIS-115. Измерьте размер и флуоресценцию определяемого вручную синапса, добавив в конвейер модули MeasureObjectSizeShape и MeasureObjectIntensity. Затем вычислите относительную интегрированную интенсивность флуоресценции, добавив модуль CalculateMath и разделив интегрированные единицы интенсивности, полученные от JSIS37, полученными из UIS-115.
По готовой экспорту все измерения и расчеты. Для измерения мышечной клеточной области открыть изображение в программном обеспечении Фиджи и использовать полигон отбора тщательно проследить вокруг одной косой мышечной клетки. Отрегулируйте линию полигона в конце, перетащив якорную точку, чтобы улучшить трассировку.
Перейдите на вкладку Анализ в верхней части программного обеспечения и нажмите Мера для расчета выбранной области. Для мышечных клеток с вырожденной или отсутствуют области проследить недостающие области с инструментом выбора полигона и нажмите Мера снова. Если есть несколько пробелов, проследуй каждый по отдельности.
Рассчитайте отношение области зазора к области всей ячейки. Высокое соотношение указывает на более высокую степень мышечной дегенерации. А если отсутствуют регионы, то соотношение рассчитывается как ноль.
Откройте Elastic и выберите классификацию пикселей в рамках создания нового проекта. Затем переименуй и сохраните проект. Перейдите на вкладку входных данных и нажмите Добавить новые, а затем добавить отдельные изображения.
Навечь всплывающее окно на папку с файлами TIF и выберите нужное изображение. Во вкладке «Выбор функций» нажмите кнопку «Выбрать функции», чтобы выбрать все пиксельные объекты, указанные зелеными галочками. Выбор пикселей на этом этапе используется для различения различных классов пикселей на следующем этапе.
Используйте учебную панель, чтобы различать отдельные GFP-выражение миозиновых нитей и нежелательных фон. Нажмите на Add Label и каракули нежелательных фонов и пробелов между нитями, чтобы начать обучение классификатора. Добавьте вторую метку, переименуйте ее в Filament и нацарапайте несколько нитей.
Нажмите на Live Update, чтобы убедиться, что классификация выполнена правильно. При необходимости добавьте больше каракули, чтобы точно настроить обучение. После того, как учебный классификатор был выполнен, перейдите к панели экспорта прогнозов и нажмите на Параметры выбора экспортного изображения с вероятностями в качестве источника.
Убедитесь, что вырез субрегионов х и у галочку, и с unticked. Выберите ноль и один в качестве значений начала и остановки для c, и конвертировать тип данных в неподписанным 8-битным. Tick Renormalize, а затем изменить видео выходного файла на png, переименование файла и каталога по желанию.
Закройте окно настроек экспорта и экспорту изображения, которое только что было сегментировано. Затем откройте файл png в программном обеспечении Фиджи. Отрегулируйте порог изображения с помощью настроек по умолчанию и примените плагин скелетизации, который создаст отдельную таблицу результатов.
Этот протокол был использован для изучения функции альфа-тубулина ацетилтрансферазы MEC-17 в разработке синапса. Количественный анализ изображений заднего/бокового микротрубокона или синапсов PLM показывает, что переэкспрессия MEC-17 нарушает нормальную функцию нейронов. По сравнению с дикими типами контроля животных, переэкспрессивных MEC-17 значительно снизили пресинаптические области и синаптической целостности.
Эти методы также были использованы для анализа C.elegans модели Шарко-Мари-Зуб типа 2 или CMT2 проведения мутаций в CMT2 связанных генов. Визуальная оценка морфологии мышц стенки тела выявила увеличение дефектов у испытуемых животных в 2,5-3,5 раза по сравнению с контролем дикого типа. У животных с мутациями в ФЗ-1 и UNC-116 наблюдалась потеря мышечных полос, накопление клеточного мусора и дегенерация мышечных волокон.
В то время как животные с мутациями в дин-1 испытывали значительно меньше дефектов в мышечной морфологии. Мутанты fzo-1 и unc-116 показали пяти-шестикратное увеличение соотношения разрыва к общей площади одноклеточной и значительно более короткую среднюю длину волокна по сравнению с животными дикого типа. Для сопоставления образцов важно определить наиболее оптимальные условия для получения изображений и обеспечить последовательное использование этих условий.
Эти методы позволят исследователям сравнить морфологические изменения в различных генетических фонов с количественными подходами. Это снижает субъективность и, следовательно, помогает повысить представительность генерируемых данных.
